一种小麦ω-5醇溶蛋白的分离提取方法

本发明属于小麦醇溶蛋白分离纯化的，具体涉及一种小麦ω-5醇溶蛋白的分离提取方法。

背景技术：

1、小麦及其制品广泛存在于日常饮食中，是我国重要的主食之一，在东方膳食结构中具有重要地位。然而，小麦也是诱发多种过敏性疾病和自身免疫疾病的主要食物来源之一，属于“八大类”食品过敏原。

2、醇溶蛋白是引发小麦过敏的主要过敏原，根据电泳迁移率的不同，醇溶蛋白被分为α/β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和ω-醇溶蛋白，其中根据流动性和序列的不同，ω-醇溶蛋白又被分为ω1-、ω2和ω5型三种不同的亚型。ω5-醇溶蛋白的分子量为49-55kd，在整个醇溶蛋白中的含量比例为3-6%，其也是小麦依赖运动诱发过敏反应和儿童速发过敏的主要过敏原。

3、现有的醇溶蛋白提取方法多采用有机溶剂（如石油醚、丙酮等）对小麦粉进行脱脂处理，使用磷酸盐缓冲液等对脱脂样品进行清洗，进一步采用70-80%的乙醇作为提取溶剂，将乙醇溶剂蒸发后得到醇溶蛋白，如申请号为201610791387.6的专利使用了上述方法，但是，使用这种方法具有以下缺陷：1.所得样品中醇溶蛋白的纯度较低，杂质较多；2.使用有机溶剂易污染环境；3.乙醇蒸发后的样品中醇溶蛋白的含量会大量损失，难以进一步分离纯化获得ω5-醇溶蛋白；4.若保留部分乙醇溶剂，虽然醇溶蛋白保存较多，但乙醇将会破坏层析柱中填料的结构，无法对醇溶蛋白分离纯化得到ω5-醇溶蛋白。

4、因此，提供一种对环境无污染、高纯度小麦ω5-醇溶蛋白的提取分离技术成为本领域亟需解决的问题。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种小麦ω5-醇溶蛋白的分离提取方法，通过对小麦粉进行适当的清洗及抽提、层析柱洗脱等操作，获得了高纯度的ω5-醇溶蛋白，该方法克服了现有技术的缺陷，可以绿色、有效地分离小麦ω5-醇溶蛋白，提高了所得ω5-醇溶蛋白的纯度。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明提供了一种小麦ω-5醇溶蛋白的分离提取方法，所述分离提取方法包括以下步骤：

4、（1）粉碎：粉碎小麦得到小麦粉；

5、（2）清洗：将小麦粉加入清洗液a中进行一次清洗，常温搅拌后离心，再次使用清洗液a对沉淀进行二次清洗，清洗后将沉淀加入清洗液b中进行清洗，离心，取清洗好的沉淀备用；

6、（3）抽提：取（2）中清洗好的沉淀，加入抽提液对沉淀匀浆，离心后留取上清，将获得的上清液进行阳离子交换层析；

7、（4）上样洗脱：用平衡液对层析柱进行平衡直至基线平稳，上样后加入洗脱液进行洗脱；

8、（5）收集：收集不同紫外吸收峰的样品，然后取样进行鉴定。

9、其中，所述（1）中将小麦置于粉碎机中粉碎后过80目筛得到小麦粉。

10、其中，所述（2）中清洗液a为pbs溶液（10mm，ph 7.4），清洗液b为10mm pbs，0.5%sds，0.4%tween20，ph 7.4。本发明使用清洗液主要为去除小麦粉中的水溶性和盐溶性蛋白，相应的，还可以使用na2co3-nahco3缓冲液等其他盐溶液对小麦粉中的水溶性蛋白和盐溶性蛋白进行清除，使用具有相同清除水溶性蛋白和盐溶性蛋白作用的溶液也在本发明的保护范围之内。

11、其中，所述（2）中用清洗液a对小麦粉清洗2次（小麦粉与清洗液a的比例为1:10，w/v，下文简写为1:10，w/v），进行两次离心时均为6000rpm，4℃离心20 min；将沉淀加入清洗液b中清洗1次，6000rpm，4℃离心20 min离心保留沉淀。

12、其中，所述（3）中用抽提液将沉淀匀浆后（沉淀与抽提液的比例为1:5，w/v，下文简写为1:5，w/v），于4 ℃过夜抽提，将匀浆液离心（1000rpm，30min）后取上清液；所述抽提液为10 mm醋酸-醋酸钠缓冲液，2m尿素，ph 3.7。4 ℃过夜抽提目的在于充分抽提小麦粉中的醇溶蛋白，低温长时间抽提可确保目的蛋白的活性。所述抽提液提取的为小麦醇溶蛋白，采用阳离子交换层析柱可以进一步分离提纯ω5-醇溶蛋白，当替换为其他不同类型的层析柱（如阴离子交换层析柱等）可以对其他不同亚型的醇溶蛋白进行分离提取，如α/β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和ω1-醇溶蛋白等，其它类似不需要付出创造性劳动对其他不同亚型的醇溶蛋白进行分离提取的替换也在本发明的保护范围之内。

13、其中，所述（4）中采用akta explorer 100仪器对样品中ω5-醇溶蛋白进行分离提取，用平衡液进行阳离子交换层析柱平衡后，上样洗脱；所述平衡液为10 mm醋酸-醋酸钠缓冲液，2m尿素，ph 3.7。

14、优选的，所述（4）具体为：用平衡液对阳离子交换层析柱平衡至基线平稳后，加入上清液样品，再次用平衡液进行平衡至基线平稳后，采用0-100%线性洗脱。

15、其中，所述（5）中收集不同紫外吸收峰液体，分别取样进行sds-page、westernblot和质谱鉴定。

16、在上述方案的基础上，所述方法同样适用于提取大米、玉米等中醇溶蛋白，进一步分离提纯ω5-醇溶蛋白，对所用物料比例、清洗时间、提取时间等适当调整以获得相应醇溶蛋白也在本发明的保护范围之内。

17、本发明的有益效果在于：

18、（1）本发明所提供的分离提取方法获得的ω5-醇溶蛋白杂质较少，大大提高了ω5-醇溶蛋白的纯度，可达95 %，填补了高纯度提取ω5-醇溶蛋白的技术空白；

19、（2）本发明在提取ω5-醇溶蛋白时无需使用石油醚、丙酮等有机溶剂，减少了对环境的污染，为绿色、高效提取醇溶蛋白提供了一种新的思路。

技术特征：

1.一种小麦ω-5醇溶蛋白的分离提取方法，其特征在于，所述分离提取方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，（1）中小麦经粉碎后过80目筛得到小麦粉。

3.如权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，（1）中将小麦置于粉碎机中粉碎后过筛得到小麦粉。

4.如权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，（2）中，一次清洗时，小麦粉与清洗液a的比例为1:10，w/v；二次清洗时沉淀与清洗液a的比例为1:10，w/v。

5.如权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，（2）中所述离心均为在6000rpm，4℃下离心20 min。

6.如权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，（3）中，用抽提液将沉淀匀浆后，于4℃过夜抽提，匀浆液于1000rpm下离心30min，离心后取上清液。

7.如权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，（3）中，所述沉淀与抽提液的比例为1:5，w/v。

8.如权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，（3）中所述抽提液为10 mm醋酸-醋酸钠缓冲液，2m尿素，ph 3.7。

9.如权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，（4）中所述平衡液为10 mm醋酸-醋酸钠缓冲液，2m尿素，ph 3.7。

10.如权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，（4）具体为：用平衡液对阳离子交换层析柱平衡至基线平稳后，加入上清液样品，再次用平衡液进行平衡至基线平稳后，采用0-100%线性洗脱。

技术总结
本发明属于小麦醇溶蛋白分离纯化的技术领域，具体涉及一种小麦ω‑5醇溶蛋白的分离提取方法。本发明的分离提取方法包括以下步骤：（1）粉碎；（2）清洗；（3）抽提；（4）上样洗脱；（5）收集。由本发明提供的分离提取方法得到的ω‑5醇溶蛋白的纯度高，可达95%，且无需使用有机溶剂，为绿色、高效提取ω‑5醇溶蛋白提供了一种新的思路。

技术研发人员：杜方岭,许利丽,徐同成,宗爱珍
受保护的技术使用者：山东省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16