一株高产只含四条脂肪酸链的类脂A(lipidIVA)的大肠杆菌

本发明涉及一株高产只含四条脂肪酸链的类脂a(lipid iva)的大肠杆菌，属于基因工程与生物工程。

背景技术：

1、脂多糖(lipopolysaccharide，lps)或称内毒素，是革兰氏阴性菌外膜上不可或缺的结构，在维持外膜完整性、调节宿主免疫反应、对抗菌肽的耐药性等方面发挥着关键作用。lps通常由以下三种结构组成：亲水性的核心多糖和o-抗原以及疏水性的类脂a。其中类脂a基团真正具有内毒素活性，通过raetz途径合成，以udp-氨基葡萄糖乙酸酐(udp-glcnac)为底物，先由六种酶(lpxa、lpxc、lpxd、lpxh、lpxb、lpxk)依次催化得到lipid iva，随后kdo转移酶waaa依次将两个kdo基团添加到lipid iva上，产生kdo2-lipid iva，最后晚期酰基转移酶lpxl和lpxm分别往c2'和c3'位各添加一条c12:0和c14:0酰基链得到kdo2-lipida。在低温下，lpxp可以取代80％的lpxl往kdo2-lipid iva的c2'位添加c16:1酰基链。

2、大肠杆菌中类脂a的生物合成途径和转运机制已比较明确，因此经常被用来鉴定其他革兰氏阴性菌类脂a的结构修饰机制。目前已构建的能合成四酰化类脂a和五酰化类脂a的大肠杆菌，包括mkv15和mlk1067在内，其缺点在于带有氯霉素及卡那霉素等抗性标记。使得菌株在培养过程中需额外添加抗生素，可能影响菌体生长并带来额外的操作成本。

技术实现思路

1、技术问题：

2、本发明要解决的技术问题是提供一种新型的缺乏晚期酰基转移酶的大肠杆菌，该菌株可以在不添加抗生素、无需诱导的条件下在37℃下高效合成只含有四条脂肪酸链的类脂a结构。

3、技术方案：

4、本发明在crispr/cas9基因编辑技术基础上，通过优化敲除过程中的条件与分子操作技术进行无痕敲除，构建了一株不带抗性标记、缺乏三个次级酰基转移酶、只合成四条脂肪酸链类脂a的大肠杆菌基因工程菌。该菌株遗传背景清晰，在37℃下生长状况良好，并可用于鉴定其他革兰氏阴性菌的类脂a次级酰基转移酶编码基因，也可作为改造类脂a结构以制备疫苗佐剂的底盘菌株。

5、为了解决上述存在的技术问题，本发明提供了一种生产类脂a的基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌w3110为出发菌株，依次敲除了基因组上三个编码类脂a次级酰基转移酶的基因lpxl、lpxm以及lpxp，获得缺失菌株w3110△lpxlmp，即wh300。

6、所述lpxl的序列的ncbi上登陆号为nc_007779.1(1,117,239..1,118,159)，lpxm的序列的ncbi上登陆号为nc_007779.1(1,940,936..1,941,907)，lpxp的序列的ncbi上登陆号为nc_007779.1(2,501,091..2,502,011)。

7、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌过表达vp_rs00880。

8、在一种实施方式中，以pbad33为表达质粒。

9、本发明的第二个目的是提供一种构建所述基因工程菌的方法，所述方法为将目的基因的上下游同源臂重叠片段与连接有目的基因靶序列互补的n20序列的ptargetf敲除质粒通过电转转入含有温敏质粒pcas的w3110中，获得含有敲除质粒与温敏质粒的突变菌株；再分别通过加入诱导剂iptg与通过高温培养去除敲除质粒与温敏质粒，最终获得生产类脂a的无抗重组大肠杆菌。

10、在一种实施方式中，所述目的基因为lpxl、lpxm和lpxp。

11、所述lpxl的序列的ncbi上登陆号为nc_007779.1(1,117,239..1,118,159)，lpxm的序列的ncbi上登陆号为nc_007779.1(1,940,936..1,941,907)，lpxp的序列的ncbi上登陆号为nc_007779.1(2,501,091..2,502,011)；所述lpxl、lpxm和lpxp的氨基酸序列的ncbi上登录号依次为genbank:baa35852.1、genbank:baa15663.1和genbank:baa16248.1。

12、在一种实施方式中，所述方法的具体步骤如下：

13、(1)构建带有与目的基因的上下游序列同源的同源臂的片段，所述片段大小为600-800bp；

14、(2)在ptargetf质粒中引入与目的基因靶序列互补的n20序列，获得ptargetf开环质粒；

15、(3)将质粒pcas转化到大肠杆菌w3110中，得到含有pcas质粒的重组大肠杆菌w3110/pcas；

16、(4)将步骤(1)的同源臂与步骤(2)的ptargetf开环质粒转化至步骤(3)的重组大肠杆菌w3110/pcas，筛选并验证获得正确的阳性转化子；

17、(5)将阳性转化子转接至液体培养基中，iptg诱导去除ptargetf质粒，获得去除敲除质粒ptargetf的菌株；

18、(6)将步骤(5)的菌株再接种于液体培养基中，高温培养消除pcas质粒，获得去除pcas质粒的菌株。

19、在一种实施方式中，在步骤(6)获得的菌株中过表达vp_rs00880。

20、在一种实施方式中，以pbad33为表达质粒。

21、在一种实施方式中，基因lpxl对应的n20序列如seq id no.1所示，基因lpxm对应的n20序列如seq id no.2所示，所述lpxp基因对应的n20序列如seq id no.3所示。

22、在一种实施方式中，所述lpxl基因的上下游同源臂重叠片段如seq id no.7所示，所述lpxm基因的上下游同源臂重叠片段如seq id no.8所示，所述lpxp基因的上下游同源臂重叠片段如seq id no.9所示。

23、本发明还提供了所述基因工程菌在鉴定未知基因功能中的应用，所述应用为鉴定未知基因是否具有类脂a次级酰基链转移酶的功能，具体步骤为：

24、(4)将含有未知基因的表达载体转入所述基因工程菌中，诱导表达；

25、(5)提取类脂a并鉴定类脂a的结构；

26、(6)根据步骤(2)测定的类脂a的结构判定未知基因是否具有类脂a次级酰基链转移酶的功能。

27、在一种实施方式中，步骤(2)中，通过lc-ms或tlc分析类脂a的结果。

28、在一种实施方式中，步骤(2)中，使用blighdyer混合体系提取类脂a。

29、所述基因工程菌在制备脂质a中的应用。

30、所述基因工程菌在制备疫苗佐剂中的应用。

31、有益效果：

32、本发明通过基因编辑技术快速构建了大肠杆菌w3110△lpxlmp菌株，该菌株不带抗性标记，可以在37℃下良好生长，并仅合成只含有四条脂肪酸链的类脂a结构，产物单一，有利于分离纯化，并且可用于在大肠杆菌中快速有效地鉴定其他革兰氏阴性菌的类脂a次级酰基转移酶编码基因，并为改造类脂a结构以制备疫苗佐剂提供了底盘菌株。

33、本发明提供的构建大肠杆菌w3110△lpxlmp菌株的方法的敲除效率达到95％以上，即在构建缺失株时平板上生长得到的菌落中95％以上为缺失株。