一种肌醇-3-磷酸合成酶突变体及其制备方法、应用和肌醇的制备方法与流程

本发明属于肌醇生物合成，尤其涉及一种肌醇-3-磷酸合成酶突变体及制备方法、构建体及构建方法、复合酶剂、应用及肌醇制备方法。

背景技术：

1、肌醇(mi)，也称为环己烷醇，是葡糖醛酸的直接前体，广泛分布于植物、动物和微生物中，是人、动物和微生物生长的必需物质。肌醇作为一种营养补充剂，被广泛应用于医药、食品、饲料等行业，市场需求量逐年增大。目前，全球的需求量已突破每年13000吨，由于目前肌醇的高售价，使得肌醇的市场前景还未得到充分的开发。

2、目前，肌醇的生产工艺主要包括加压水解法、常压水解法、酶水解法、微生物发酵法和体外酶合成法等方法。其中，加压水解法的技术成熟，可直接获得大量的肌醇，但是该工艺设备材质要求严格，一次性投资大；操作压力必须控制在一定的范围内，限制了原材料利用率的提高，且粗产品精制工艺复杂，损失较多，生产成本较高，且该工艺会产生大量的磷酸污染物，对水源等环境污染严重。常压水解法虽然对设备要求低、生产流程简化且催化剂可循环利用，但是所得的肌醇纯度低，限制了其的应用。酶水解法具有反应条件温和和对环境污染小的优点，但是存在着酶活性低、原料利用率低等问题。微生物发酵法的生产成本低，但是存在着菌种改造耗时长，难以调节碳流量分布以及难以积累g-6-p等问题。体外酶合成法具有生产工艺环保和肌醇产率高的优点，但是仍存在着酶不稳定的问题。以上现有的肌醇的生产工艺中均不同程度的存在成本高、原料利用率低以及产率低等问题，具有较大的局限性。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种肌醇-3-磷酸合成酶突变体，相较于原始的肌醇-3-磷酸合成酶突变体，通过对原始肌醇-3-磷酸合成酶的结合结构域和催化结构域进行结构优化，所得的肌醇-3-磷酸合成酶突变体具有t261p突变、a274r突变和i367y突变中的至少一种，从而赋予了该肌醇-3-磷酸合成酶突变体更强的底物结合能力和更高的催化活性，能够被很好地应用于肌醇的体外非发酵生物合成中，与肌醇单磷酸酶以及任选的麦芽糊精磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶协同作用，高效催化麦芽糊精转化为肌醇的过程，可实现有效提高麦芽糊精利用率和肌醇产率的效果。

2、本发明的第二目的在于提供一种构建体。

3、本发明的第三目的在于提供以上构建体的构建方法。

4、本发明的第四目的在于提供以上肌醇-3-磷酸合成酶突变体的制备方法。

5、本发明的第五目的在于提供一种复合酶剂。

6、本发明的第六目的在于提供以上肌醇-3-磷酸合成酶突变体和/或复合酶剂的应用。

7、本发明的第七目的在于提供一种肌醇的制备方法。

8、具体的，本发明提供的肌醇-3-磷酸合成酶突变体与原始肌醇-3-磷酸合成酶相比，包括t261p突变、a274r突变和i367y突变中的一种或多种，且所述原始肌醇-3-磷酸合成酶包括序列如seq id no:1所示的氨基酸片段或与seq id no:1所示序列具有至少80％同源性的变体序列。

9、在一些具体的实施方式中，所述肌醇-3-磷酸合成酶突变体包括序列如seq idno:2所示的氨基酸片段或与seq id no:2所示序列具有至少90％同源性的变体序列。

10、在一些具体的实施方式中，所述肌醇-3-磷酸合成酶突变体包括序列如seq idno:3所示的氨基酸片段或与seq id no:3所示序列具有至少90％同源性的变体序列。

11、在一些具体的实施方式中，所述肌醇-3-磷酸合成酶突变体包括序列如seq idno:4所示的氨基酸片段或与seq id no:4所示序列具有至少90％同源性的变体序列。

12、在一些具体的实施方式中，所述肌醇-3-磷酸合成酶突变体包括序列如seq idno:5所示的氨基酸片段或与seq id no:5所示序列具有至少90％同源性的变体序列。

13、在一些具体的实施方式中，所述肌醇-3-磷酸合成酶突变体包括序列如seq idno:6所示的氨基酸片段或与seq id no:6所示序列具有至少90％同源性的变体序列。

14、在一些具体的实施方式中，所述肌醇-3-磷酸合成酶突变体包括序列如seq idno:7所示的氨基酸片段或与seq id no:7所示序列具有至少90％同源性的变体序列。

15、在一些具体的实施方式中，所述肌醇-3-磷酸合成酶突变体包括序列如seq idno:8所示的氨基酸片段或与seq id no:8所示序列具有至少90％同源性的变体序列。

16、本发明提供的构建体包括编码上述肌醇-3-磷酸合成酶突变体的核苷酸片段。

17、本发明提供的构建体的构建方法包括：取序列如seq id no:9所示的核苷酸片段或与序列如seq id no:9所示的核苷酸片段具有80％同源性的变体序列重组至质粒载体，得到重组质粒；取突变引物对所述重组质粒进行定点突变，得到所述构建体。

18、在一些具体的实施方式中，所述突变引物包括t261p突变引物、a274r突变引物和i367y突变引物中的一种或多种。

19、在一些具体的实施方式中，所述t261p突变引物包括核苷酸序列如seq id no:10所示的正向引物和/或核苷酸序列如seq id no:11所示的反向引物。

20、在一些具体的实施方式中，所述a274r突变引物包括核苷酸序列如seq id no:12所示的正向引物和/或核苷酸序列如seq id no:13所示的反向引物。

21、在一些具体的实施方式中，所述i367y突变引物包括核苷酸序列如seq id no:14所示的正向引物和/或核苷酸序列如seq id no:15所示的反向引物。

22、本发明提供的所述肌醇-3-磷酸合成酶突变体的制备方法包括：取以上所述的构建体转化宿主细胞，得到生产菌株；取所述生产菌株表达肌醇-3-磷酸合成酶突变体。

23、本发明提供的复合酶剂包括上述肌醇-3-磷酸合成酶突变体和肌醇单磷酸酶以及任选的麦芽糊精磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶。

24、在一些具体的实施方式中，所述麦芽糊精磷酸化酶包括序列如seq id no:16所示的氨基酸片段或与seq id no:16所示序列具80％同源性的变体序列。

25、在一些具体的实施方式中，所述葡萄糖磷酸变位酶包括序列如seq id no:17所示的氨基酸片段或与seq id no:17所示序列具80％同源性的变体序列。

26、在一些具体的实施方式中，所述肌醇单磷酸酶包括序列如seq id no:18所示的氨基酸片段或与seq id no:18所示序列具80％同源性的变体序列。

27、在一些具体的实施方式中，以所述复合酶剂的总质量为基准，所述肌醇-3-磷酸合成酶突变体的含量为10～20wt％，所述麦芽糊精磷酸化酶的含量为10～20wt％，所述葡萄糖磷酸变位酶的含量为30～40wt％，所述肌醇单磷酸酶的含量为30～40wt％。

28、本发明还提供上述肌醇-3-磷酸合成酶突变体和/或复合酶剂在催化合成肌醇反应中的应用。

29、本发明提供的肌醇的制备方法包括：将麦芽糊精在上述肌醇-3-磷酸合成酶突变体和/或复合酶剂的存在下进行酶促反应，得到肌醇。

30、在一些具体的实施方式中，所述酶促反应的条件包括温度为50～90℃，ph为6～8，时间为12～72h。

31、有益效果：

32、本发明通过在包括序列如seq id no:1所示的氨基酸片段或与seq id no:1所示序列具有至少80％同源性的变体序列的原始肌醇-3-磷酸合成酶中引入t261p突变、a274r突变和i367y突变中的一种或多种，所获得的肌醇-3-磷酸合成酶突变体相较于原始肌醇-3-磷酸合成酶，底物结合能力和催化活性得到了明显增强，将该肌醇-3-磷酸合成酶突变体应用于肌醇的体外非发酵生物合成中，能够与肌醇单磷酸酶以及任选的麦芽糊精磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶协同配合，实现高效催化麦芽糊精转化为肌醇的效果，从而解决现有肌醇生产工艺中存在的成本高、原料利用率低以及产率低等问题，应用前景良好。