本发明属于生物医用材料领域,涉及一类高度支化聚(β-氨基酯)分离方法及得到的高度支化聚(β-氨基酯)和其在功能性col7a1 dna和tgm1 dna递送中的应用。
背景技术:
1、隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)是一种严重的遗传性皮肤疾病,其致病根源在于编码胶原vii(c7)蛋白的基因发生突变,造成皮肤真皮和表皮之间无法有效锚定,导致患者的皮肤极度脆弱,易产生水泡或溃烂,最终发展为皮肤癌。基于rdeb的致病机理,在c7蛋白相关效应细胞中和组织中介导高效的c7蛋白表达是目前最希望的治疗方法。
2、鱼鳞病是另一种严重的遗传性皮肤病。tgm1基因的种系突变主要引起常染色体隐性先天性鱼鳞病。由tgm1基因编码的转谷氨酰胺酶-1蛋白在粟粒状细胞包膜的形成过程中起着关键作用,而粟粒状细胞包膜是维持皮肤屏障完整性不可或缺的组成部分。
3、然而,由于col7a1基因和tgm1基因片段分子尺寸的差异,且易于被网状内皮系统清除或者核酸酶降解,这将严重限制col7a1 dna和tgm1 dna在递送过程中的有效压缩和细胞摄取。
4、聚(β-氨基酯)由于原料广泛易得、易于合成、化学组成和结构易于调控、可生物降解的特性,在成纤维细胞、角质形成细胞、癌细胞、干细胞、星型胶质细胞及原代细胞等各种组织细胞中表现出优异的绿色荧光蛋白(gfp)和荧光素酶(gluc)表达效率,但在功能性dna递送方面的研究较少,且由于逐步聚合物的固有缺陷往往造成其具有较宽的分子量分布,这明显限制其高效的功能性基因转染及其基因治疗临床转化的应用。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的提供一种高度支化聚(β-氨基酯)分离方法及得到的高度支化聚(β-氨基酯)和应用,该方法可以成功分离出一系列不同分子量且分子量分布较窄的高度支化聚(β-氨基酯),提升其在功能性col7a1 dna和tgm1 dna递送效率,为遗传性皮肤病治疗提供重要参考。
2、本发明通过以下技术方案实现:
3、一种高度支化聚(β-氨基酯)分离的方法,包括以下步骤:
4、1)将高度支化聚(β-氨基酯)溶解于dmso或四氢呋喃中,得到高度支化聚(β-氨基酯)溶液;
5、2)将高度支化聚(β-氨基酯)溶液滴加到混合溶剂中,搅拌、静置,取上清液并去除混合溶剂,得到一种窄分子量的高度支化聚(β-氨基酯)组分;
6、3)将步骤2)取上清液后所得的沉淀相重复进行步骤1)至步骤2)的分离过程至少一次,每重复一次,得到一种窄分子量的高度支化聚(β-氨基酯)组分,最终得到多种不同分子量的窄分子量的高度支化聚(β-氨基酯)组分;
7、其中,所述混合溶剂为丙酮和乙醚的混合溶剂、dmf和乙醚的混合溶剂或者dmso和乙醚的混合溶剂;并且,后一次采用的混合溶剂与前一次采用的混合溶剂相比,乙醚的体积分数减小。
8、优选的,步骤1)中,所述高度支化聚(β-氨基酯)的分子量为23.0~50.0kg/mol。
9、优选的,步骤1)中,高度支化聚(β-氨基酯)溶液中高度支化聚(β-氨基酯的浓度为80~200mg/ml。
10、优选的,步骤2)中,所述去除混合溶剂具体是;将上清液进行旋转蒸发。
11、优选的,步骤2)中,静置时间为15~30min。
12、优选的,步骤2)中,混合溶剂中乙醚的体积分数为85%~95%;后一次采用的混合溶剂与前一次采用的混合溶剂相比,乙醚的体积分数减小8%~12%。
13、采用所述的方法得到的高度支化聚(β-氨基酯),所述高度支化聚(β-氨基酯)为任意一种所述窄分子量的高度支化聚(β-氨基酯)组分。
14、一种复合纳米粒子,为所述的高度支化聚(β-氨基酯)与dna的复合纳米粒子。
15、所述的高度支化聚(β-氨基酯)或所述的复合纳米粒子在制备基因载体中的应用,所述基因载体用于递送基因至组织或细胞。
16、优选的,所述基因为编码c7蛋白的dna或编码tgm1蛋白的dna。
17、与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
18、本发明通过复配出不同体积比的不同极性溶剂组成的混合溶剂,根据不同分子量聚合物在不同体积比的混合溶剂中的溶解性差异,经过逐级沉淀成功分离出了一系列不同分子量且分子量分布较窄的高度支化聚(β-氨基酯),可显著降低产品批次差异,为其进一步的临床授权提供了重要支撑。该分离方法简单高效,所用原料便宜易得,成本低、对设备要求低,适合产业化分离。其与目前本领域技术中主要采用的商业化dna转染试剂jetpei、lipo3000相比,分离出的窄分子量分布的高度支化聚(β-氨基酯)更具临床治疗的潜力。生物物理性能表征表明,分离出的窄分子量分布的高度支化聚(β-氨基酯)与dna形成的复合物纳米粒子具有更为均匀的粒径分布和批次重现性。同时,在对应的效应细胞中,逐级沉淀分离能够显著的提升窄分子量分布的高度支化聚(β-氨基酯)对于col7a1 dna和tgm1 dna转染效率,为遗传性皮肤病治疗和临床转化提供重要参考。
19、本发明方法分离出的高度支化聚(β-氨基酯)与dna所形成的复合物纳米粒子分布较为均匀、稳定性良好、可生物降解,具有良好的生物相容性。体外功能性基因的转染结果表明,在对应的皮肤效应细胞中分离出的窄分子量分布的高度支化聚(β-氨基酯)能够高效地介导c7蛋白和tgm1蛋白表达,且保持较高的细胞活性,这证明分离出的窄分子量的高度支化聚(β-氨基酯)在功能性dna递送及rdeb、鱼鳞病基因治疗方面具有重要的应用潜力。
1.一种高度支化聚(β-氨基酯)分离方法,其特征在于,包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的高度支化聚(β-氨基酯)分离方法,其特征在于,步骤1)中,所述高度支化聚(β-氨基酯)的分子量为23.0~50.0kg/mol。
3.根据权利要求1所述的高度支化聚(β-氨基酯)分离方法,其特征在于,步骤1)中,高度支化聚(β-氨基酯)溶液中高度支化聚(β-氨基酯的浓度为80~200mg/ml。
4.根据权利要求1所述的高度支化聚(β-氨基酯)分离方法,其特征在于,步骤2)中,所述去除混合溶剂具体是;将上清液进行旋转蒸发。
5.根据权利要求1所述的高度支化聚(β-氨基酯)分离方法,其特征在于,步骤2)中,静置时间为15~30min。
6.根据权利要求1所述的高度支化聚(β-氨基酯)分离方法,其特征在于,步骤2)中,混合溶剂中乙醚的体积分数为85%~95%;后一次采用的混合溶剂与前一次采用的混合溶剂相比,乙醚的体积分数减小8%~12%。
7.采用权利要求1~6任一项所述的方法得到的高度支化聚(β-氨基酯),其特征在于,所述高度支化聚(β-氨基酯)为任意一种所述窄分子量的高度支化聚(β-氨基酯)组分。
8.一种复合纳米粒子,其特征在于,为权利要求7所述的高度支化聚(β-氨基酯)与dna的复合纳米粒子。
9.权利要求7所述的高度支化聚(β-氨基酯)或权利要求8所述的复合纳米粒子在制备基因载体中的应用,其特征在于,所述基因载体用于递送基因至组织或细胞。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述基因为编码c7蛋白的dna或编码tgm1蛋白的dna。