一种动态调控角鲨烯合成的工程菌及其构建方法与应用

本发明涉及生物，特别涉及一种动态调控角鲨烯合成的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、角鲨烯(squalene)是一种开链三萜类化合物，目前主要是从鲨鱼肝脏中提取，也有少量的从植物源中提取，包括橄榄、大豆、米糠等植物，不过因为技术原因目前还无法大规模量产。近年来，角鲨烯在制药、保健、化妆品和食品行业中表现出巨大的商业前景，获得了市场的青睐，但是从鲨鱼肝油中提取角鲨烯这类传统方法存在环保、伦理等诸多问题，因此，研究者们试图通过合成生物学的手段，利用微生物实现可持续、高效率的角鲨烯生产。

2、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)是一种天然的产油酵母，含有大量合成萜类物质和脂类物质时所必需的重要前体物质--乙酰辅酶a，同时，独特的脂滴结构也为角鲨烯这类疏水性产物的储存提供了得天独厚的条件。然而，在解脂耶氏酵母中，乙酰辅酶a的通量主要用于脂质生物合成，这极大的影响了萜类化合物的形成潜力，所以限制脂质代谢的碳通量可能是提高y.lipolytica中萜类化合物产量的有效手段。通过破坏脂肪酸合成的关键基因，可以减少脂质合成，但是会导致酵母生长减缓和生物量减少，因此需要设计有效的动态调控策略来调控脂肪酸合成关键基因的表达，平衡脂质合成和萜类合成之间的关系。

3、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的转录因子fapr是一种响应丙二酰coa的转录因子，能够结合在操纵子fapo上影响rna聚合酶调控启动子下游基因转录。目前，有关利用转录因子fapr与丙二酸单酰coa相互作用这一特性，设计负反馈调节电路并偶联crispr干扰系统，开发crispr介导的转录调控系统来调控脂肪酸合成关键基因多肽脂肪酸合成酶fas2转录水平的方法在解脂耶氏酵母中还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用丙二酰辅酶a生物传感器(fapo/fapr系统)偶联crispr干扰系统动态调控解脂耶氏酵母中脂肪酸合成代谢进而提高角鲨烯产量的动态调控角鲨烯合成的工程菌。

2、本发明的另一目的在于，提供上述工程菌的构建方法。

3、本发明的再一目的在于，提供上述工程菌的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种丙二酰辅酶a生物传感器，包括转录因子fapr、整合了操纵子fapo的启动子及受其调控的能下调目的基因表达的crispr干扰系统。

6、所述的生物传感器能表达转录因子fapr，fapr会结合到操纵子fapo形成fapr-dna复合物阻止表达，当丙二酸单酰coa与fapr结合引发fapr构象变化，导致fapr-dna复合物解离，整合了操纵子fapo的启动子启动crispr干扰系统中sgrna的表达，引导整合到基因组上的dead cas9(dcas9)蛋白靶向目的序列，从而下调目标基因的表达。

7、所述的整合了操纵子fapo的启动子为整合了操纵子fapo的启动子sctef，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

8、所述的转录因子fapr为来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的基因fapr(geneid:936595)，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

9、所述的目的基因为多肽脂肪酸合成酶编码基因fas1、多肽脂肪酸合成酶编码基因fas2、乙酰辅酶a羧化酶1编码基因acc1中的至少一种；优选为多肽脂肪酸合成酶编码基因fas2。

10、上述的fas1基因的ncbi数据库序列登记号为yali0_b15059g。

11、上述的fas2基因的ncbi数据库序列登记号为yali0_b19382g。

12、上述的acc1基因的ncbi数据库序列登记号为yali0_c11407g。

13、所述的crispr干扰系统包括dcas9表达盒和包含grna靶向序列的sgrna表达盒。

14、上述的dcas9表达盒为质粒addgene#91248上包含的dcas9表达盒。

15、上述的grna靶向序列为grna-fas1、grna-fas2、grna-acc2中的至少一种，其中grna-fas1的核苷酸序列如seq id no.3所示，grna-fas2的核苷酸序列如seq id no.4所示，grna-acc1的核苷酸序列如seq id no.5所示。

16、一种动态调控角鲨烯合成的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

17、(1)将角鲨烯合成相关基因转入解脂耶氏酵母进行表达得到合成角鲨烯的工程菌；

18、(2)将角鲨烯合成途径上游相关基因和丙二酰辅酶a生物传感器转入步骤(1)得到的合成角鲨烯的工程菌中进行表达，得到动态调控角鲨烯合成的工程菌。

19、步骤(1)所述的角鲨烯合成相关基因包括hmgr基因(羟甲基戊二酰辅酶a还原酶，hydroxymethylglutaryl-coa reductase，hmgr)、idi基因(异戊烯基二磷酸异构酶，isopentenyl-diphosphate delta-isomerase，idi)、sqs基因(角鲨烯合酶，squalenesynthetase,sqs)、faa1基因(脂肪酰基-coa合成酶1，fatty acyl-coa synthetase 1,faa1)。

20、步骤(1)所述的转入解脂耶氏酵母进行表达是通过将包括角鲨烯合成相关基因的片段和crispr/cas9操作载体共转化后定位进行表达的；优选的，sqs、hmgr、idi基因是定位至基因组rdna整合位点进行表达的，faa1基因是定位至基因组d17整合位点进行表达的。

21、上述的hmgr基因的ncbi数据库序列登记号为yali0e04807g。

22、上述的idi基因的ncbi数据库序列登记号为yali0b16038g。

23、上述的sqs基因的ncbi数据库序列登记号为yali0a10076g。

24、上述的faa1基因的ncbi数据库序列登记号为yali0d17864g。

25、上述的crispr/cas9操作载体包括grna靶向序列grna-rdna(seq id no.6)或grna-d17(seq id no.7)中的至少一种。

26、上述包括角鲨烯合成相关基因的片段还包括用于表达基因的相关元件。

27、步骤(2)所述的角鲨烯合成途径上游相关基因包括aact基因(乙酰辅酶a硫解酶，acetoacetyl-coa thiolase，aact)、hmgs基因(羟甲基戊二酰乙酰辅酶a合酶，hydroxymethylglutaryl-coa synthase，hmgs)、hmgr基因(羟甲基戊二酰辅酶a还原酶，hydroxymethylglutaryl-coa reductase，hmgr)。

28、步骤(2)所述的转入解脂耶氏酵母进行表达是通过将包括角鲨烯合成途径上游相关基因的片段、丙二酰辅酶a生物传感器分别与crispr/cas9操作载体共转化后定位进行表达的；优选的，aact、hmgs、hmgr基因是定位至线粒体(e1整合位点)或过氧化物酶体(c2整合位点)进行表达的，丙二酰辅酶a生物传感器是定位至基因组f17整合位点进行表达的。

29、上述的aact基因的ncbi数据库序列登记号为yali0b08536g。

30、上述的hmgs基因的ncbi数据库序列登记号为yali0f30481g。

31、上述的hmgr基因的ncbi数据库序列登记号为yali0e04807g。

32、上述的crispr/cas9操作载体包括grna靶向序列grna-e1(seq id no.8)、grna-c2(seq id no.9)、grna-f17(seq id no.10)中的至少一种。

33、上述的包括角鲨烯合成途径上游相关基因的片段还包括了线粒体定位信号(mitochondrial location signal,mls)或过氧化物酶体定位信号(enhanced peroxisometarget signal,epts)。

34、上述的线粒体定位信号的氨基酸序列为mlslrqsirffkpatrtlcssryllq，其对应的编码基因的核苷酸序列如seq id no.12所示。

35、上述的过氧化物酶体定位信号的氨基酸序列为lgrgrrskl，其对应的编码基因的核苷酸序列如seq id no.14所示。

36、上述的包括角鲨烯合成途径上游相关基因的片段还包括用于表达基因的相关元件。

37、上述的crispr/cas9操作载体为包括sgrna靶向序列的crispr/cas9操作载体；优选为以质粒pcas1yl为骨架组装得到的crispr/cas9操作载体。

38、上述的解脂耶氏酵母宿主菌为解脂耶氏酵母po1fδku70δku80，该菌株的构建方法可参照中国专利申请cn108949599a和cn114806911b。

39、一种工程菌，包括上述生物传感器。

40、一种动态调控角鲨烯合成的工程菌，通过上述构建方法制备得到。

41、上述的丙二酰辅酶a生物传感器在生产角鲨烯中的应用。

42、上述的动态调控角鲨烯合成的工程菌在生产角鲨烯中的应用。

43、上述的应用，具体包括以下步骤：

44、将动态调控角鲨烯合成的工程菌接种于ypd培养基中，培养温度为20～30℃，转速220～250rpm，培养时间为60～90h，培养完成后，萃取发酵液得到角鲨烯。

45、所述的ypd培养基组成为：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，余量为水，ph5.7～5.8，115℃，灭菌20min。

46、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

47、(1)本发明公开了一种丙二酰辅酶a生物传感器(fapo/fapr系统)偶联crispr干扰系统动态调控解脂耶氏酵母中脂肪酸合成代谢进而提高角鲨烯产量的方法，首次在严格好氧微生物解脂耶氏酵母中构建丙二酰辅酶a生物传感器。本发明的工程菌株po1f s7能够利用含葡萄糖的培养基高效合成角鲨烯。通过丙二酰辅酶a生物传感器动态调控脂肪酸合成并利用含葡萄糖的培养基合成甲羟戊酸及下游萜类化合物，使得解脂耶氏酵母合成甲羟戊酸及下游萜类化合物的产率大幅提高。

48、(2)实验结果证明，工程菌株po1f s7利用葡萄糖摇瓶发酵72h合成角鲨烯的产量分别可达752.31mg/l，而未使用丙二酰辅酶a生物传感器合成角鲨烯的对照工程菌株po1fs2利用葡萄糖生产角鲨烯的产量仅为622.44mg/l。

49、(3)本发明通过动态调控脂肪酸合成提高了萜类化合物合成的产量，利用微生物合成法来生产甲羟戊酸下游萜类化合物，极大地提高了所述菌株的应用附加值，有利用解决植物提取法和化学合成法所带来的环境污染、效率低下、反应过程繁琐等问题，具有可观的应用前景和经济价值。