一种结直肠癌的诊断生物标志物及检测方法

本发明属于分子生物学，发明了一种结直肠癌的诊断生物标志物及检测方法，涉及一种与结直肠癌相关的生物标志物的检测，尤其涉及一种基于循环肿瘤细胞mrna组合的结直肠癌诊断生物标志物用于结直肠癌的诊断。

背景技术：

1、结直肠癌(crc)已成为全球发病率第三的实体恶性肿瘤。结直肠癌是为数不多的采用适当筛查方法可以发现癌前病变或早期肿瘤，从而通过适宜临床干预降低发病率和病死率的恶性疾病。结直肠癌的发生发展大多遵循“腺瘤-癌”序列，从癌前病变进展到癌一般需要5～10年的时间，为疾病的早期诊断和临床干预提供了重要时间窗口。crc通过早期发现和治疗，如结肠镜检查和外科检查，患者的5年生存率可提高至90％。肠镜为公认的筛查金标准，但由于侵入性、肠道准备和高成本等因素，依从性低，无法成为大规模筛查手段。粪便免疫化学检测(fit)是无创和经济的，但fit在检测结直肠腺瘤(aa)方面的准确性较低，且只有约5％的接受结肠镜检查的个体会发现有重要的病变(crc或aa)。因此，亟需开发一种高灵敏、高特异地非侵入性结直肠癌结直肠癌诊断方法。

2、循环肿瘤细胞(ctcs)是指来源于原发或转移肿瘤、脱落进入外周血液循环中的肿瘤细胞。由于其携带原发性或转移性病灶的重要信息，并且能够通过血液循环播散至全身其他组织器官，因此ctcs被视为一种具有前景的非侵入性癌症诊断标志物。通过纯化外周血样本中的ctcs，并分析其内的特征性分子，如蛋白质、mrna、lncrna等，有望实现无创、连续、实时的动态监测，这为结直肠癌的及时诊断提供了新的方向，如cn111521800a公开通过外周血循环肿瘤细胞检测结直肠癌患者pd-l1基因表达的免疫荧光试剂盒。

3、综上所述，开发新型的与结直肠癌相关的生物标志物以及相应检测方法，扩充结直肠癌的诊断、腺瘤进展监测的技术手段，对于发现早期结直肠癌具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种与结直肠癌相关的生物标志物及其应用，为结直肠癌的诊断提供新方法、新思路。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供与结直肠癌相关的生物标志物及其检测试剂在制备检测结直肠癌的产品中的应用；所述与结直肠癌相关的生物标志物包括转谷氨酰胺酶2(tgm2)、上皮细胞黏附分子(epcam)、二肽酶1(dpep1)，基质金属肽酶14(mmp14)和跨膜4l超家族成员1(tm4sf1)的组合，和/或，转谷氨酰胺酶2的编码核酸、上皮细胞黏附分子的编码核酸、二肽酶1的编码核酸、基质金属肽酶14的编码核酸和跨膜4l超家族成员1的编码核酸的组合；所述编码核酸包括mrna或cdna。

4、本发明首次发现结直肠血液循环肿瘤细胞中的转谷氨酰胺酶2(tgm2)、上皮细胞黏附分子(epcam)，二肽酶1(dpep1)，基质金属肽酶14(mmp14)，跨膜4l超家族成员1(tm4sf1)及其编码核酸与结直肠癌发展相关，其在结直肠癌患者中过表达、但在正常结直肠组织和结直肠腺瘤组织中低表达或无表达，可有效应用于结直肠癌的诊断、腺瘤进展监测等。

5、优选地，所述检测试剂包括检测所述与结直肠癌相关的生物标志物的存在或表达水平的试剂。

6、优选地，所述试剂包括与结直肠癌相关的生物标志物的pcr引物和/或探针。

7、第二方面，本发明提供一种与结直肠癌相关的生物标志物的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括捕获抗体及第一方面中所述的检测试剂；所述捕获抗体包括上皮黏附分子的抗体和表皮生长因子受体的抗体(用于修饰捕获结直肠癌循环肿瘤细胞的免疫磁珠)。

8、第三方面，本发明提供第二方面所述的诊断试剂盒的使用方法，所述使用方法的步骤包括：

9、利用第方面所述捕获抗体修饰的免疫磁珠从受试者的生物样本中分离纯化结直肠癌循环肿瘤细胞；

10、将结直肠癌循环肿瘤细胞裂解后提取rna，并将其反转录成cdna；

11、利用pcr进行定量检测cdna，计算权利要求1中所述与结直肠癌相关的生物标志物的cdna对应的mrna的表达水平；

12、检测受试者血清癌胚抗原的表达水平；

13、以所述mrna的表达水平和血清癌胚抗原的表达水平为特征，利用构建的结直肠癌诊断模型获取受试者crc诊断评分，用于诊断结果。

14、优选地，所述分离纯化结直肠癌循环肿瘤细胞的方法包括：离心分离受试者外周血单核细胞，将外周血单核细胞与所述捕获抗体和免疫磁珠混合，收集免疫磁珠。

15、优选地，所述免疫磁珠，包括二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳上依次修饰有抗粘附层和链霉亲和素，所述抗粘附层的成分为聚磺酰氨基甲基丙烯酸酯(psbma)，能够降低外周血单核细胞等非特异性黏附，以提高ctcs的捕获效率。

16、优选地，所述捕获抗体包括上皮黏附分子(epcam)的抗体、表皮生长因子受体(egfr)的抗体。

17、优选地，所述生物样品包括外周血。

18、第四方面，本发明提供第三方面所述的结直肠癌诊断模型构建方法，所述方法包括：基于第一方面血清癌胚抗原的表达水平和所述与结直肠癌相关的生物标志物的表达水平和，利用极致梯度提升决策树(xgboost)建立诊断模型。

19、优选地，所述诊断模型的输入变量包括受试者的第一方面所述的与结直肠癌相关的生物标志物表达水平，以及血清癌胚抗原(cea)的表达水平，所述诊断模型的输出变量为受试者的评分crc score，所述crc score极致梯度提升决策树(xgboost)模型构建所用超参数如下：

20、输入数据为：a1，a2，a3，a4，a5和a6，树的列采样率为0.8，树的最大深度为3，构建决策树的数量为150，子样本比例为0.8，学习率为0.01；

21、其中，a1表示转谷氨酰胺酶2(tgm2)或其编码核酸的表达水平，a2表示上皮细胞黏附分子(epcam)或其编码核酸的表达水平，a3表示二肽酶1(dpep1)或其编码核酸的表达水平，a4表示基质金属肽酶14(mmp14)或其编码核酸的表达水平，a5表示跨膜4l超家族成员1(tm4sf1)或其编码核酸的表达水平，a6表示血清癌胚抗原(cea)的表达水平。

22、优选地，结直肠癌阳性的判断标准为：crc score>0.488。

23、第五方面，本发明提供一种结直肠癌的诊断标志物的检测方法，所述检测方法包括信息获取模块、计算模块和诊断模块。

24、所述信息获取模块用于执行包括：

25、获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括第一方面所述与结直肠癌相关的生物标志物和血清癌胚抗原的表达水平信息。

26、所述计算模块用于执行包括：

27、将所述生物标志物和血清癌胚抗原的表达水平信息代入第四方面所述的结直肠癌的诊断模型，计算crc score值；

28、所述诊断模块用于执行包括：

29、根据所述crc score值判断所述受试者的健康状况的操作，结直肠癌阳性的判断标准为：crc score>0.488。

30、本发明中，在样本来源上，可通过捕获外周血中的ctcs能够有效获取crc癌灶部位的生物信息进行诊断，可以无损地动态监测肿瘤状态。

31、本发明中，用epcam、egfr抗体靶向结直肠癌特异的ctcs，并利用修饰的免疫磁珠对外周血中的crc来源ctcs进行特异性捕获，其中免疫磁珠包括二氧化硅外壳、抗粘附层和链霉亲和素，抗粘附层成分为聚磺酰氨基甲基丙烯酸酯(psbma)，能够降低外周血单核细胞等非特异性黏附，以提高ctcs的捕获效率。抗体可先与循环肿瘤细胞样本混合后再与免疫磁珠混合，也可先与免疫磁珠混合再与循环肿瘤细胞样本混合。

32、本发明中，所述诊断模型和装置可应用于辅助结直肠癌诊断。

33、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

34、本发明首次发现转谷氨酰胺酶2、上皮细胞黏附分子，二肽酶1，基质金属肽酶14，跨膜4l超家族成员1及其编码核酸与结直肠癌发生及发展相关，对其mrna水平进行检测，同时联用受试者临床血清肿瘤标志物癌胚抗原(cea)的表达水平，利用极致梯度提升决策树(xgboost)模型建立crc诊断模型，具备的诊断性能优于临床上常用血清肿瘤标志物cea，在训练集上准确率可达91％，灵敏度和特异度分别可达93％和89％，在测试集上准确率可达88％，灵敏度和特异度分别可达85％和92％，说明该诊断模型对于crc具有极佳的诊断能力。此外，本发明建立的crc诊断模型能够更早发现腺瘤向结直肠癌进展的预警信号。