靶点为Nectin-4的抗体及其应用的制作方法

本发明属于细胞免疫学与生物，具体涉及靶点为nectin-4的抗体及其应用，尤其是单b细胞抗体及其应用。

背景技术：

1、nectin-4为脊髓灰质炎病毒受体相关-4（pvrl-4）编码蛋白，其是一种不依赖ca2+的免疫球蛋白样蛋白。nectin-4与其他连接蛋白例如nectin-1，nectin-2和nectin-3共同作用以参与细胞-细胞粘附。与其他nectin相比，nectin-4在人胚胎和胎盘组织中特异性富集，成年后表达显著下降。近年来，研究发现，在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中，nectin-4尤其过表达并作为肿瘤相关诱导剂。在一些类型的癌症中，nectin-4的过表达与肿瘤进展的各个方面有关，如增殖、血管生成、上皮向间质转化、转移、dna修复、肿瘤复发、预后不良等（subhajit et al.,2021）。

2、nectin-4属于i型跨膜蛋白，具有2种剪切变异体。包括nectin-4在内的nectin家族膜蛋白均具有以下特点：1）由三个保守的ig样环（一个igv环，两个igc环）组成的胞外结构区；2）一个跨膜结构域；3）含有afadin（粘附连接蛋白）结合基序的细胞质结构域。nectin胞外区通过反式相互作用以同嗜性和异嗜性的方式相互作用介导细胞间的相互连接。它们还与其他ig样分子发生异嗜性相互作用，表现出调节免疫系统等多种生物学功能。nectin胞质域与afadin结合，并与细胞骨架中的肌动蛋白建立相互作用。关于连接蛋白的上述分子结构，也有少数例外。nectin-1γ不具有跨膜结构域和细胞质结构域，被认为是一种分泌蛋白。nectin-1β和nectin-3γ在膜内区中不具有afadin结合基序。其余的连接蛋白具有glu/alax-tyr-val基序，与afadin的pdz结构域结合（takahashi et al.,1999;takai etal.,2008a,b;samanta and almo,2015）。研究表明，生长因子受体与nectin igv和igc环的相互作用可能调节细胞的生长、迁移和凋亡（bojesen et al.,2012）。

3、具体来说，nectin-4是一个55.5kda的蛋白，由510个氨基酸组成，具有nectin家族典型的3个结构域结构。在其n端还含有一个信号肽。nectin-4与afadin通过c端保守的gly-his-leu-val基序相互作用。pvrl-4基因包含9个外显子。外显子1、2和3分别编码信号肽、v-type1和c2-type1 loops。外显子4和5编码c2-type2 loop。跨膜区由第6外显子编码，第7、8、9外显子编码胞质区。

4、nectin-4在实体瘤中，可通过激活p13k/akt通路促进肿瘤的增殖和迁移（akai etal.,2008a,b）。nectin-4具有两个有趣的特性：一方面，作为介导麻疹病毒进入细胞的细胞表面受体，nectin-4具有可诱导且高效的内化作用，可以介导抗体药物高效内吞；另一方面，nectin-4在成年人健康组织中表达有限，却在恶性肿瘤细胞中过度表达，这种差异性表达模式可以实现药物的靶向治疗，将不良事件的风险降到最低。鉴于以上特征，nectin-4成为了靶向治疗的诱导靶标，其巨大的临床潜力也在其靶向adc（抗体偶联药物）开发过程中得以证实。

5、抗体发现是生物制药领域和诊断试剂行业比较重要的研发项目，目前常见的抗体发现技术主要包括：杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单b细胞抗体筛选技术。

6、根据研究应用，可以随机或抗原选择性地从外周血或淋巴组织（如骨髓、脾脏）中分离单b细胞。对于b细胞分离，目前单b细胞分选方式有流式细胞分选法、磁珠细胞分选法、显微操作法、激光显微切割法以及微流控分选法。其中流式细胞荧光分选技术（fluorescence activated cell sorting，facs）是目前一种成熟、有效的单细胞分选方法。

7、现在fda已经批准针对nectin-4 靶点的药物enfortumab vedotin，该药物适应症是尿路上皮癌，并证明了该靶点具有良好的成药性。基于靶点nectin-4良好的成药性，利用优化的单b细胞抗体发现平台，发现该靶点的一些新的抗体序列，用于下一步的成药性分析，是本发明亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、第一方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含根据seq id no: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19任一项所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含根据seq idno: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20任一项所示的氨基酸序列。

2、较佳地，所述抗体或抗原结合片段包含：所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:2所示的氨基酸序列；或者

3、所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:4所示的氨基酸序列；或者

4、所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:5所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:6所示的氨基酸序列；或者

5、所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:8所示的氨基酸序列；或者

6、所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:10所示的氨基酸序列；或者

7、所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:12所示的氨基酸序列；或者

8、所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:13所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:14所示的氨基酸序列；或者

9、所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:15所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:16所示的氨基酸序列；或者

10、所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:18所示的氨基酸序列；或者

11、所述重链可变区的互补决定区cdr-h3包含seq id no:19所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区cdr-l3包含seq id no:20所示的氨基酸序列。

12、较佳地，所述重链可变区包含互补决定区cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中cdr-h1包含根据seq id no:40、43、46、49、52、55、58、61、64、67所示的氨基酸序列，cdr-h2包含根据seq id no:41、44、47、50、53、56、59、62、65、68所示的氨基酸序列，cdr-h3包含根据seq idno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含互补决定区cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中cdr-l1包含根据seq id no:42、45、48、51、54、57、60、63、66、69所示的氨基酸序列，cdr-l2包含aas氨基酸序列、yts氨基酸序列、was氨基酸序列、dts氨基酸序列、tts氨基酸序列、sss氨基酸序列、aas氨基酸序列、sis氨基酸序列，cdr-l3包含根据seq idno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20所示的氨基酸序列。

13、较佳地，所述重链可变区包含seq id no:40所示的cdr-h1、seq id no:41所示的cdr-h2和seq id no:1所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:42所示的cdr-l1、aas氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:2所示的cdr-l3；或者

14、所述重链可变区包含seq id no:43所示的cdr-h1、seq id no:44所示的cdr-h2和seq id no:3所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:45所示的cdr-l1、yts氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:4所示的cdr-l3；或者

15、所述重链可变区包含seq id no:46所示的cdr-h1、seq id no:47所示的cdr-h2和seq id no:5所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:48所示的cdr-l1、was氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:6所示的cdr-l3；或者

16、所述重链可变区包含seq id no:49所示的cdr-h1、seq id no:50所示的cdr-h2和seq id no:7所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:51所示的cdr-l1、dts氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:8所示的cdr-l3；或者

17、所述重链可变区包含seq id no:52所示的cdr-h1、seq id no:53所示的cdr-h2和seq id no:9所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:54所示的cdr-l1、yts氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:10所示的cdr-l3；或者

18、所述重链可变区包含seq id no:55所示的cdr-h1、seq id no:56所示的cdr-h2和seq id no:11所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:57所示的cdr-l1、tts氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:12所示的cdr-l3；或者

19、所述重链可变区包含seq id no:58所示的cdr-h1、seq id no:59所示的cdr-h2和seq id no:13所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:60所示的cdr-l1、dts氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:14所示的cdr-l3；或者

20、所述重链可变区包含seq id no:61所示的cdr-h1、seq id no:62所示的cdr-h2和seq id no:15所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:63所示的cdr-l1、sss氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:16所示的cdr-l3；或者

21、所述重链可变区包含seq id no:64所示的cdr-h1、seq id no:65所示的cdr-h2和seq id no:17所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:66所示的cdr-l1、aas氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:18所示的cdr-l3；

22、所述重链可变区包含seq id no:67所示的cdr-h1、seq id no:68所示的cdr-h2和seq id no:19所示的cdr-h3，所述轻链可变区包含seq id no:69所示的cdr-l1、sis氨基酸序列的cdr-l2和seq id no:20所示的cdr-l3。

23、较佳地，所述重链可变区包含选自seq id no: 21、23、25、27、29、31、33、34、36、38任一项所示的氨基酸序列或与其同源性为至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自seq id no: 22、24、26、28、30、32、28、35、37、39任一项所示的氨基酸序列或与其同源性为至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的氨基酸序列。

24、较佳地，所述抗体或抗原结合片段包含：所述重链可变区包含根据seq id no:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id no:22所示的氨基酸序列；或者

25、所述重链可变区包含根据seq id no:23所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id no:24所示的氨基酸序列；或者

26、所述重链可变区包含根据seq id no:25所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id no:26所示的氨基酸序列；或者

27、所述重链可变区包含根据seq id no:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id no:28所示的氨基酸序列；或者

28、所述重链可变区包含根据seq id no:29所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id no:30所示的氨基酸序列；或者

29、所述重链可变区包含根据seq id no:31所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id nq:32所示的氨基酸序列；或者

30、所述重链可变区包含根据seq id no:33所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id no:28所示的氨基酸序列；或者

31、所述重链可变区包含根据seq id no:34所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id no:35所示的氨基酸序列；或者

32、所述重链可变区包含根据seq id no:36所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id no:37所示的氨基酸序列；或者

33、所述重链可变区包含根据seq id no:38所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据seq id no:39所示的氨基酸序列。

34、较佳地，所述抗体或抗原结合片段的靶点为nectin-4。

35、较佳地，所述抗体为单b细胞抗体。

36、第二方面，本发明提供上述任一项所述的抗体或抗原结合片段用于制备预防和/或治疗癌症和/或炎性疾病的药物的用途。

37、较佳地，所述癌症是与nectin-4表达异常、过量、失控相关的癌症。

38、第三方面，本发明提供一种核酸，其编码上述任一项所述的抗体或抗原结合片段中的一种或多种。

39、第四方面，本发明提供一种载体，所述载体包含根据所述核酸。

40、第五方面，本发明提供一种药物组合物，其包含根据上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

41、本发明提供的抗体序列靶点为nectin-4，可以作为nectin-4表达异常或过量、失控的癌症的抗体药物开发的候选序列。 而且，本发明利用重链及轻链可变区天然配对的优势，更有利于取得亲和力及特异性俱佳的抗体序列，增加后续抗体药物开发的成功率。