一种人胎盘绒毛外泌体快速提取试剂盒、提取方法、胎盘外泌体及应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种人胎盘绒毛外泌体快速提取试剂盒、提取方法、胎盘外泌体及应用。

背景技术：

1、外泌体（exosome）是细胞内多囊泡核内体在成熟过程中，向内出芽形成的腔内小泡，直径30~100 nm，当与细胞膜融合被释放到细胞外。外泌体在疾病发生发展及治疗过程中的潜在作用及其机制一直是生物医药领域的研究热点。不论是在致病机制研究还是治疗作用探索的研究中，对患病组织有针对的获得高质量高浓度的外泌体有利于相关实验的高效进行。高效提取胎盘外泌体，研究其组成及生物学功能，尤其是在妊娠并发症中的改变，对于阐释妊娠并发症发生机制及寻找新的治疗方法具有重要临床意义。

2、胎盘是胎儿与母体之间的交界处，主要起着营养供给、呼吸、排泄、免疫保护等作用。近年来研究显示，胎盘分泌的特异性外泌体（exosomes）由胎盘细胞释放，包含丰富的生物分子，如rna、蛋白质、dna和细胞外囊泡。这些生物分子通过绒毛间隙直接进入母体血液循环，影响母体的生理机能，尤其在母胎免疫耐受、子宫螺旋动脉重塑以及胎盘屏障等维持妊娠过程中发挥重要作用。

3、随着对胎盘外泌体研究的不断深入，胎盘外泌体的分离方法也多种多样，这些分离方法都是基于胎盘外泌体的物理生化特性建立的，包括利用沉降系数不同进行超速差速离心、利用密度差异进行密度梯度离心、利用颗粒大小差异进行超滤、利用胎盘外泌体具有一定疏水性进行沉淀，以及在此基础上改良的方法。但由于胎盘外泌体纯化和鉴定技术的限制，不同的提取方法所得到的外泌体差异较大，同样存在外泌体纯度不够、提取率低，胎盘外泌体发挥的生物学作用不能得到明确详尽的解释，因此有必要建立高效的胎盘外泌体的分离纯化方法。

4、故基于此，提出本发明的技术方案。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明的方案是提供一种人胎盘绒毛外泌体快速提取试剂盒，其包括如下原料：混合酶、第一清洗缓冲液和第二清洗缓冲液；其中：

2、所述混合酶包括iv胶原蛋白水解酶、中性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶i；

3、所述第一清洗缓冲液为磷酸盐缓冲液；

4、所述第二清洗缓冲液为复方氯化钠溶液。

5、优选地，所述iv胶原蛋白水解酶的浓度为1~3mg/ml；

6、和/或，所述中性蛋白酶的浓度为2.3~2.5u/ml；

7、和/或，所述脱氧核糖核酸酶i的浓度为24~26μg/ml；

8、和/或，所述磷酸盐缓冲液中，nacl的浓度为7.8~8.0mg/ml、kcl的浓度为0.1~0.3mg/ml、na2hpo4的浓度为1.4~1.5mg/ml、kh2po4的浓度为1.7~1.9mg/ml；

9、和/或，所述复方氯化钠溶液中，nacl的浓度为5~7mg/ml、kcl的浓度为0.2~0.4mg/ml、cacl2的浓度为0.1~0.3mg/ml、c3h3nao3的浓度为3~3.2mg/ml。

10、优选地，所述iv胶原蛋白水解酶的浓度为2mg/ml；

11、和/或，所述中性蛋白酶的浓度为2.4u/ml；

12、和/或，所述脱氧核糖核酸酶i的浓度为25μg/ml；

13、和/或，所述磷酸盐缓冲液中，nacl的浓度为7.9mg/ml、kcl的浓度为0.2mg/ml、na2hpo4的浓度为1.44mg/ml、kh2po4的浓度为1.8mg/ml；

14、和/或，所述复方氯化钠溶液中，nacl的浓度为6mg/ml、kcl的浓度为0.3mg/ml、cacl2的浓度为0.2mg/ml、c3h3nao3的浓度为3.1mg/ml。

15、基于相同的技术构思，本发明的再一方案是提供一种人胎盘绒毛外泌体的快速提取方法，所述快速提取的方法包括如下步骤：

16、（1）将胎盘组织浸入所述复方氯化钠溶液进行预处理，得到胎盘绒毛；

17、（2）将所述胎盘绒毛剪碎后加入所述混合酶混匀，然后消化得到胶冻样胎盘组织液；

18、（3）向所述胶冻样胎盘组织液中加入所述磷酸盐缓冲液并进行离心，弃沉淀，得到第一上清液；

19、（4）向所述第一上清液中再次加入所述磷酸盐缓冲液并进行离心，得到第二上清液；

20、（5）向所述第二上清液再次加入所述磷酸盐缓冲液并进行离心，得到第三上清液

21、（6）将所述第三上清液进行多重离心，完成后得到所述人胎盘绒毛外泌体。

22、优选地，步骤（2）中，所述消化的温度为36~38℃，消化的时间为25~30min。

23、优选地，步骤（3）中，所述离心的条件为：3~5℃，350~450g，8~12min。

24、优选地，步骤（4）中，所述离心条件为：3~5℃，480~520g，8~12min。

25、优选地，步骤（5）中，所述离心的条件为：3~5℃，1800~2200g，8~12min。

26、优选地，步骤（6）中，将所述第三上清液在3~5℃，480~520g条件下离心8~12min后取上清；再于3~5℃，1800~2200g条件下离心18~22min后取上清；再于3~5℃，9800~12000g条件下离心28~32min后取上清；最后于3~5℃，110000~130000g条件下离心1.5~2.5h，完成后得到所述人胎盘绒毛外泌体。

27、基于相同的技术构思，本发明的再一方案是提供一种由上述快速提取方法得到的人胎盘绒毛外泌体。

28、基于相同的技术构思，本发明的再一方案是提供一种人胎盘绒毛外泌体在外泌体测序、妊娠期外泌体介导信息传递中的应用。

29、应用一：组织外泌体联合体液外泌体测序进行标志物研究。

30、外泌体测序技术可以系统性揭示外泌体所携带的遗传物质、转录产物及蛋白质组成，是外泌体相关研究中常见且备受关注的技术。而通过胎盘组织外泌体联合体液外泌体测序的标志物研究，我们能够直观的深入了解胎盘组织外泌体中所含有的生物分子，这些分子可能承载着关于妊娠、胎儿发育和母体健康状态的重要信息。通过分析胎盘组织来源外泌体并与血浆外泌体进行比对，我们可以实现早期诊断和监测妊娠期并发症的目的，为母婴健康提供更加全面、精确的医疗服务。这一技术具体应用包括但不限于：

31、（1）胎盘发育和功能研究；

32、（2）妊娠相关疾病研究；

33、（3）妊娠期营养研究；

34、（4）新生儿发育和健康状态监测，先天性疾病的研究。

35、外泌体内容物测序的技术流程包括:外泌体悬液的获取、外泌体富集分离和文库构建、测序、数据分析及可视化解读。组织外泌体联合体液外泌体测序进行标志物研究中，通常需要获取足量、高纯度且来源确定的组织来源外泌体用于后续测序分析等相关研究流程。事实上，从组织中获得高质量的外泌体是研究的第一要务，也是确保外泌体分离实验顺利进行以及最终成功获取测序数据的关键步骤。

36、应用二：妊娠外泌体介导信息传递的生物学功能研究

37、妊娠期外泌体介导信息传递的生物学功能研究具有深远的科学意义和临床价值。通过深入探究外泌体在妊娠过程中的功能，我们能够揭示胎盘、母体和胎儿之间复杂的信号传递网络，了解其对妊娠和胎儿发育的调控作用。这有助于早期发现和预防妊娠并发症，为提升母婴健康水平、预防并发症、开发新的治疗方法提供重要的科学依据。这一技术具体应用包括但不限于：

38、（1）妊娠相关生物学过程研究；

39、（2）妊娠期间免疫调节及血管生成；

40、（3）妊娠相关并发症的早期诊断及预防；

41、（4）胎儿发育和成熟研究；

42、（5）妊娠相关疾病的治疗；

43、（6）个性化医疗和干预策略的发展。

44、当进行妊娠外泌体介导信息传递的生物学功能研究时，需要获得足量、高纯度且来源确定的组织来源外泌体，以确保后续测序分析、细胞或动物实验等相关研究流程的可靠性和准确性。同时，精确的组织采集和处理技术也是至关重要的，以保证所获取的外泌体的来源和纯度的可靠性。此外，选择合适的外泌体分离方法和工具也是关键，以确保简单、快速、低成本的分离得到高纯度的外泌体。组织外泌体的分离这一步骤被认为是整个实验的基石，直接影响到外泌体分离实验的顺利进行以及成功获取所需的测序数据。

45、本发明的有益效果为：

46、1、本发明所述的人胎盘绒毛外泌体快速提取试剂盒，从众多酶类中选出中性蛋白酶、胶原酶iv、脱氧核糖核酸酶i这三种酶，相比于其他公开的发明专利酶类组合更加符合胎盘绒毛的组织学特征，筛选优化的混合酶种类及浓度更具有针对性和高效性。这为业内公认的较难解离的含胶原较多且内含细胞种类多的组织类型获取单细胞提供了良好的工具，具体的：

47、中性蛋白酶在适合的温度和ph条件下可以水解非极性氨基酸残基的n端肽键，能破坏细胞外基质而不破坏细胞之间的连接，因此主要用于细胞集落的分离和将组织块分解成小块细胞，是一种内切酶，适用于多种动物蛋白水解。

48、胶原酶是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内，适用于富含胶原的如皮肤、结直肠等组织类型的解离，胎盘组织液富含胶原蛋白；胶原酶具有6种分型，即胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶iii、胶原酶iv、胶原酶v、胶原酶vi，而胎盘组织主要为iv型胶原蛋白，因此选用iv胶原蛋白水解酶进行组织解离。

49、脱氧核糖核酸酶i是一种可以消化单链或双链dna产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶,在细胞核内和胞浆中广泛存在，适用于剪切基因组dna，在组织解离的过程中避免dna链对解离组分的包裹，保障酶解效率。

50、2、本发明所述的人胎盘绒毛外泌体的高效提取方法，使用混合酶完整解离胎盘绒毛组织，相比广谱同时使用多种胶原酶的方法更节约成本和时间，提高胎盘外泌体提取的稳定性、纯度以及浓度，浓度提高了50%以上。