一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用。

背景技术：

1、ryr1基因编码骨骼肌肌浆网上的i型兰尼碱受体，i型兰尼碱受体是由4个分子量约为560 kda的亚基组成的同源四聚体，调节肌浆网内钙离子的释放，参与骨骼肌兴奋-收缩偶联过程。ryr1基因的遗传性突变与恶性高热、横纹肌溶解、中央轴空病等一系列神经肌肉疾病有关。

2、ryr1基因编码哺乳动物体内最大的钙通道蛋白，编码ryr1蛋白氨基酸的mrna序列超过15kb。组织聚合酶链反应（polymerase chain reaction，pcr）是一种常用的分子生物学技术，近年来用于检测和放大组织样本中的特定dna或rna序列，方法操作方便、实验室污染风险低；但是尽管现有各种pcr技术不断升级改良，然而现有技术手段仍很难从复杂的基因组中特异性扩增出超大片段的dna，因而限制了对ryr1基因功能的研究；此外，随着合成生物学的不断发展，人类能够通过实验室手段在体外合成dna序列，但限于扩增能力不足，合成dna片段通常在3-4 kb，无法满足对于ryr1基因表达及功能的体外研究需要。因而，亟需提供一种ryr1基因表达质粒及其构建方法，可以用于全长ryr1基因的扩增。

技术实现思路

1、鉴于上述的分析，本发明实施例旨在提供一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用，用以解决现有技术难以扩增得到全长ryr1基因，无法满足对于ryr1基因表达及功能的体外研究需要的问题。

2、本发明的目的主要是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供了一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

4、s1：将pcdna3.1-3myc-his质粒通过hindiii和bamhi酶切质粒反应体系进行双酶切，得到线性化载体；

5、s2：获取小鼠ryr1基因片段ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c和ryr1-d，将ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c和ryr1-d分别连接到线性化载体中，分别构建含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒和含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒；

6、s3：采用pcr扩增体系对含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到pcr产物，采用电泳回收pcr产物，得到扩增后的ryr1基因片段；

7、s4：通过无缝克隆的方式将扩增后的ryr1基因片段连接到线性化载体上，构建得到全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒。

8、进一步地，步骤s2包括以下步骤：

9、s21：获取小鼠骨骼肌组织rna；

10、s22：小鼠骨骼肌组织rna逆转录合成小鼠骨骼肌组织cdna；

11、s23：以小鼠骨骼肌组织cdna为模板，将小鼠全长ryr1基因分成4段，分别为ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c和ryr1-d，经pcr反应分段扩增；

12、s24：通过同源重组的方式，分别将扩增后的ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c、ryr1-d基因片段，连接到步骤s1中得到的线性化载体中，构建分别含有ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c、ryr1-d的重组表达质粒。

13、进一步地，步骤s23中，

14、所述ryr1-a基因片段pcr反应的上游引物序列如seq id no.3所示；

15、所述ryr1-a基因片段pcr反应的下游引物序列如seq id no.4所示；

16、所述ryr1-b基因片段pcr反应的上游引物序列如seq id no.5所示；

17、所述ryr1-b基因片段pcr反应的下游引物序列如seq id no.6所示；

18、所述ryr1-c基因片段pcr反应的上游引物序列如seq id no.7所示；

19、所述ryr1-c基因片段pcr反应的下游引物序列如seq id no.8所示；

20、所述ryr1-d基因片段pcr反应的上游引物序列如seq id no.9所示；

21、所述ryr1-d基因片段pcr反应的下游引物序列如seq id no.10所示。

22、进一步地，步骤s24中，

23、所述含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒序列如seq id no.11所示；

24、所述含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒序列如seq id no.12所示；

25、所述含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒序列如seq id no.13所示；

26、所述含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒序列如seq id no.14所示。

27、进一步地，步骤s3中，

28、所述含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒pcr反应的上游引物序列如seq idno.15所示；

29、所述含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒pcr反应的下游引物序列如seq idno.16所示；

30、所述含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒pcr反应的上游引物序列如seq idno.17所示；

31、所述含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒pcr反应的下游引物序列如seq idno.18所示；

32、所述含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒pcr反应的上游引物序列如seq idno.19所示；

33、所述含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒pcr反应的下游引物序列如seq idno.20所示；

34、所述含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒pcr反应的上游引物序列如seq idno.21所示；

35、所述含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒pcr反应的下游引物序列如seq idno.22所示。

36、进一步地，步骤s4中，所述扩增后的ryr1基因片段包括用于同源重组的ryr1-a基因片段、用于同源重组的ryr1-b基因片段、用于同源重组的ryr1-c基因片段和用于同源重组的ryr1-d基因片段；

37、所述用于同源重组的ryr1-a基因片段序列如seq id no.23所示；

38、所述用于同源重组的ryr1-b基因片段序列如seq id no.24所示；

39、所述用于同源重组的ryr1-c基因片段序列如seq id no.25所示；

40、所述用于同源重组的ryr1-d基因片段序列如seq id no.26所示。

41、本发明还提供了一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒，根据上述的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法得到，所述全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒全长包括20599个碱基对，第1-10000位碱基如seq id no.1所示，第10001-20599位碱基如seq idno.2所示。

42、本发明还提供了一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的应用，根据上述全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法得到的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒在研究恶性高热发病机制上的应用。

43、本发明还提供了一种ryr1-p.arg2509cys质粒的构建方法，包括以下步骤：

44、步骤1：将pcdna3.1-3myc-his质粒通过hindiii和bamhi酶切质粒反应体系进行双酶切，得到线性化载体；

45、步骤2：获取小鼠ryr1基因片段ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c和ryr1-d，将ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c和ryr1-d分别连接到线性化载体中，分别构建含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒和含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒；

46、步骤3：设计引物在含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒上引入点突变，使7525-7527位碱基序列由cga突变为tgc；

47、步骤4：采用pcr扩增体系对含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-b基因片段（带突变位点）的重组表达质粒、含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到pcr产物，采用电泳回收pcr产物，得到扩增后的ryr1基因片段；

48、步骤5：通过无缝克隆的方式将扩增后的ryr1基因片段连接到线性化载体上，构建得到带有突变位点的ryr1-p.arg2509cys质粒。

49、本发明提供了一种ryr1-p.arg2509cys质粒在模拟人类恶性高热实验模型的应用。

50、与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：

51、1、本发明提供了一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用，该构建方法可获得ryr1基因的全长表达质粒，操作简易、可重复性强、蛋白表达量高、结果稳定，可以用于全长ryr1基因的扩增。

52、2、本发明的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒及其构建方法，为实现ryr1基因的分子克隆、点突变实验提供了可能，可满足对于ryr1基因表达及功能的体外研究的需要以及基因突变在疾病模型中的应用。

53、3、本发明的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒及其构建方法，通过在小鼠ryr1基因表达质粒上做点突变引入相应的突变位点，构建了ryr1-p.arg2509cys质粒，可以模拟人类恶性高热实验模型，检测ryr1基因上某种碱基序列的变化是否具有致病性，以及研究该突变导致恶性高热的发病机制。

54、本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。