植物悬浮培养物高效转化和再生的方法

专利名称:植物悬浮培养物高效转化和再生的方法
植物悬浮培养物高效转化和再生的方法
发明领域
本发明一般地涉及植物遗传工程，更特别地，涉及农杆菌(Agrobacterium)介导 的转化方法。
发明背景
在整个申请中，各种专利、公开的专利申请和出版物均作为参考。这些专利、公开 的专利申请和出版物公开的内容在此全文引入本申请作为参考，以用来更加完整地描述本 发明所属技术领域：
的现有技术水平。出版物的全部著录项目都可在权利要求
书前的参考书 目的列表中找到。
棉花是一种重要的经济作物。每年的棉花纤维产品给世界农业经济带来数十亿美 元的收益。尽管从1987年起就可进行棉花的基因转化(Firoozabady等，1987)，但现今所 使用的方法效率仍然很低，而且花费很大，这是由于转化细胞再生为植株的效率非常低，以 及花的授粉能力很低。另外冗长的再生过程也使得效率更加低下。
现在已有几种利用棉花外植体进行农杆菌介导的转化的方法，所述外植体例如子 叶(Firoozabady 等，1987)、胚轴(Umbeck 等，1987 ；美国专利号 5，004，863 和 5，159，135 ； 欧洲专利公开号EP 0 270 355)、叶柄(国际专利公开号W0 00/77230A1)和根(国际专利 公开号W0 00/53783)。另外也已经报道了用于棉花植株再生和转化的改进方法，其中使用 了胚轴过渡区(hypocotyl transition zone) (W0 98/15622)、苗端(W0 89/12102和美国专 利号5，164，310)和顶生的或结节的分生组织(W0 97/43430)。或者，棉花外植体可通过微 粒轰击转化，例如，胚轴(W0 92/15675 和 EP 0 531 506 ;McCabe 和 Martinell，1993)和胚 悬浮培养物(Finer 和 Mc Mullen，1990)。
上述提到的绝大多数方法利用体细胞胚发生(somatic embryogenesis)的再生途 径，其中需要起始、成熟和萌芽的冗长过程。体细胞胚愈伤组织或胚悬浮培养物通过农杆菌 介导的(美国专利号6，483，013 ；5，583，036)或通过微粒轰击(Finer和McMullen, 1990) 进行的转化充分地缩短了再生过程。然而，从体细胞胚转变为正常带根小植株的转化率是 非常低的，这严重阻碍了转化进程。
除再生之外，人们一直在寻找与植物(如棉花)转化密切相关的将T-DNA传递到 宿主基因组的更为有效的方法。在了解农杆菌的毒力和T-DNA接合方面已经进行了广泛的 研究。现在，人们认识到在T-DNA传递给植物细胞之前，农杆菌细胞必须通过由宿主分泌的 化学因子介导的复杂的信号传导机制识别并将自身黏附到宿主细胞上，，其中所述化学因 子的产生由机械损伤诱导。这些化学因子由一系列酚类化合物组成，例如乙酰丁香酮、芥子 酸(3，5 二甲氧基-4-羟基肉桂酸)、丁香酸(4-羟基-3，5 二甲氧基苯甲酸)、阿魏酸(4-羟 基-3-甲氧基肉桂酸)、儿茶酚(1，2_ 二羟基苯)、对羟基苯甲酸(4-羟基苯甲酸)、间 二羟基苯甲酸(2，4_ 二羟苯甲酸)、原儿茶酸(3，4_ 二羟基苯甲酸)、吡咯没食子酸(2，3， 4-三羟基苯甲酸)、没食子酸(3，4，5_三羟基苯甲酸)和香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯醛) (美国专利号6，483，013)。已经发现组成型表达的virG突变蛋白(virGN54D)能提高农杆 菌的毒力和转化效率(Hansen等，1994)。同样地，可激发农杆菌毒力的化合物例如乙酰丁香酮或胭脂碱极大地提高棉花茎尖(Veluthambi等，1989)和在固体培养基上繁殖的体细 胞胚愈伤组织(U.S. Pat. No. 6，483，013)的转化效率。其中一个实例是大量真菌的成功转 化，其中所述真菌不能分泌诱导农杆菌毒力的化合物，使得T-DNA接合必须使用乙酰丁香 酮(Bundock 等，1995 ；de Groot 等，1998)。
尽管已经经过许多的努力和尝试去改进转化方法，但目前的技术仍旧是低效、耗 时和花费巨大的。因此，一些植物，例如棉花，在对其植物发育和组织分化的分子机制的认 识上远远落后于其它主要农作物。很明显，目前的转化技术与特别是棉花的重大的经济价 值不协调，至今还没有重大突破。
在绝大部分植物(包括棉花)中，转化方法主要使用农杆菌将T-DNA传递给局限 在小表面积即外植体或愈伤组织的切割表面中的宿主细胞(美国专利号6，483，013)。这极 大的限制了基因转化的发生率，因为绝大多数宿主细胞没有与T-DNA供体直接接触。因此， 只有大约20-30%的外植体被转化(Firoozababy等，1987 ；Cousins等，1991)。以前，曾经有 人成功转化了细胞悬浮培养物，其利用的是在AT-管@或培养瓶中的液体培养基中进行共 培养(美国专利号5，583，036)。虽然没有显示具体的转化率，但我们发现这种方法的转化 率仍然很低(
图14)。这个方法的主要问题可能在于在丰富液体培养基中进行培养时农杆 菌细胞可能难以表达毒力基因，并且在持续搅拌的情况下很难粘附至植物细胞，因此T-DNA 的接合效率很低。
与在植物转化中主要应用的外植体相比，悬浮培养物中的细胞是作为单个细胞或 一小簇细胞团出现的。当前，缺乏处理和转化这些材料的有效技术。最近的研究提示液体 培养基中培养的真菌细胞在多孔膜上共培养时可被转化，所述膜平铺在使农杆菌毒力最 优化的半固体培养基上面(W0 02/00896 ；Bundock 等，1995 ；Piers 等，1996 ；de Groot 等， 1998)。使用膜或过滤介质(filter)有双重的好处。其可以有效地持续过滤掉过量的液体， 能够将T-DNA受体和供体细胞集中起来，同时能够使共培养物和培养基之间的营养物质、 矿物质和信号传导化合物有效扩散。
Finer(1988 ；EP0317512B1)在低生长素含量的液体培养基(MS盐，维生素B5， 0. lmg/1 2，4-D或0.5mg/l毒莠定，2%蔗糖)中使用源自子叶或胚轴外植体的未分化的愈 伤组织起始胚发生。随后将胚组织在含有较高生长素浓度(5mg/l 2,4-D)的类似液体培养 基中进行繁殖/维持。如果提供谷氨酰胺，则这样制备的悬浮组织在液体培养基中可发育 为成熟的胚。
Rangan等(美国专利号5，583，036和5，244，802)使用源自子叶、胚轴外植体 或是在固体培养基上产生的合子胚的未分化的愈伤组织在高水平生长素的固体培养基 (l-10mg/l)中起始体细胞胚形成，并将胚愈伤组织维持在高水平生长素(l-10mg/l)的液 体培养基中。所述培养物包含各种尺寸的胚细胞团块的混合物，并且需要定期过滤以去除 大的团块。
Trolinder和G00din(1987)在不含激素的液体培养基中起始胚发生，并在相同 的培养基中维持悬浮培养物。这种悬浮培养物中的细胞具有异源发育阶段，并以分泌暗化 (darkening)、抑制生长的化合物的大团块形式存在。
Levee等，(1999)，和美国专利申请公开号US2002/0100083A1、US2002/0083495A1、 和US2002/0092037A1涉及在共培养松树细胞中膜的使用。
5[0015]本领域需要改进的和更有效的由农杆菌介导的植物转化和再生的方法，所述植物 如棉花、玉米、大豆、小麦、水稻和大麦。
发明概述
为了克服先前报道的与植物(特别是棉花)转化方法相关的问题，本发明提供 了由农杆菌介导的将T-DNA与悬浮培养的细胞或愈伤组织接合的高效植物转化方法。在 此描述的方法使用膜或过滤介质作为共培养T-DNA供体和受体的固相支持物。特别地， 本发明提供用于生产转基因植物的方法，其中包括提供原胚植物细胞(proembryogenic plant cell)以及在液体培养基中培养所述细胞以产生细胞悬浮培养物。在多孔的固 相支持物上将所述悬浮培养物与携带包含外源基因和选择性标记的载体的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)培养物共培养，所述农杆菌能将该外源基因和选择性标记 稳定转移进所述细胞的基因组中。由此生成细胞群，从中选择出表达所述外源基因的细胞 并使之再生为转基因植物。
一方面，使用绿色荧光蛋白(GFP)作为可视标记，发现棉花细胞培养物能够以令 人惊讶的高效率转化(多至200卡那霉素抗性愈伤组织形成单位/200mg细胞)，并且能够 以比先前报道的高得多的效率再生成能育植物。
本发明的另一方面，先前未使用过的组织，例如从成熟种子切下的棉花根部或茎 尖，被用于具有胚发生能力的悬浮培养的细胞的起始培养和维持培养。
目前，已经公开了两种涉及通过农杆菌介导的T-DNA接合进行的棉花体细胞胚材 料转化的方法，分别是美国专利申请号5，583，036和6，483，013的内容。美国专利申请号 5，583，036涉及转化悬浮培养物的方法，其通过在液体培养基中共培养棉花胚愈伤组织和 携带包含感兴趣的基因的Ti质粒的根癌农杆菌进行。美国专利申请号6，483，013涉及棉 花胚愈伤组织的转化方法，所述胚愈伤组织在高生长素含量的固体培养基中进行起始培养 和繁殖培养，并在固体培养基上与根癌农杆菌共培养。两种方法都使用体细胞胚发生以再 生为能育棉花植株。这里，如同所指出的，本发明提供了用于悬浮细胞培养物转化和其再生 为能育植株的方法，是上述方法的改进。特别地，使用在多孔固相支持物如膜或过滤介质上 进行的共培养技术极大地提高了植物的转化效率。本发明的其他方面包括使用各种培养基 组合物。
附图简述
图1显示PZP111-35S :GFP的基因构成。L和R分别代表左右边界。植物选择标 记基因(NPTII)受CaMV 35S启动子和35S终止子的调控，GFP受35S启动子和Nos终止子 的调控。
图2显示在悬浮培养物中繁殖的原胚愈伤组织(S4)的结构。
图3显示悬浮培养物和溶液的暗化。(A)显示一直在LM1中培养的培养物S16 ； (B) 显示在四种不同培养基(LM1、LM2、LM3和LM4)中轮流培养的培养物S16。
图4显示细胞分裂素对体细胞胚产量的影响。约0. lmg的愈伤组织平铺在MS培 养基(基础)上，或平铺在添加了 0. 01mg/l NAA(NAA)、lmg/16BA(BA)、lmg/l 2IP 或 lmg/1 玉米素核糖核苷(ZR)的MS培养基上。S5和S16是两种悬浮培养物。一个月后记录体细胞 胚的数目。所示结果代表三个重复平板组的平均值。
图5描述了对于在R1培养基中经过两次传代培养并在R2培养基中经过一次传代培养的S5悬浮培养物，玉米素核糖核苷对体细胞胚产生的影响。平板所示如下(A)在所有 的传代培养中没有添加玉米素核糖核苷；(B)在第一次传代培养中加入lmg/1玉米素核糖 核苷(只显示两个区域)；(C)在第一次和第二次传代培养中加入lmg/1玉米素核糖核苷； (D)在三次传代培养中都加入lmg/1玉米素核糖核苷。
图6显示T-DNA受体细胞和供体细胞在尼龙膜(Hybond-N)上的共培养。
图7 (A)显示在R1固体培养基上分区(in sectors)选择；(B)在液体培养基中培 养筏(culture raft)上的选择；(C)显示共培养5天后转化的GFP+细胞。
图8显示在选择培养基R1上培养一个月后的转化的GFP+胚(A)和胚组织(B)。
图9显示共培养4个月后的发芽的胚(A)和胚样组织⑶。
图10显示源自胚样组织的带有多个芽的小植株。
图11显示源自发芽的体细胞胚的盆栽的小植株(potting ready plantlet)。
图12显示共培养7-8个月后健壮开花的植株。
图13显示来自转基因成熟叶的GFP+叶子(左组)和来自未转化的成熟株的背景 荧光。
图14显示在R1选择培养基中培养一个月后的愈伤组织部分。(A)显示按照美国 专利号5，583，036中描述的方法共培养后的结果。(B)显示根据本发明的方法获得的结果。
图15显示㈧来自野生型植株(Coker312)的新鲜花粉；(B)源自S16的转基因 植株的新鲜花粉；(C)发育不全的棉桃(boll)(源自同一植株)，其含有一些带有延长纤维 的已受精的胚珠；(D)用野生型花粉对相同的植株传粉10天后膨大的棉桃。
发明详述
本发明一般涉及生产转基因植物(优选棉花、玉米、大豆、小麦、水稻和大麦，最优 选为棉花)的方法，，所述转基因植物通过将至少一种感兴趣的基因的一个拷贝整合到核 基因组中而表达该基因。特别地，本发明提供生产转基因植物的方法，所述方法包括提供原 胚植物细胞，并在液体培养基中培养所述细胞以产生细胞悬浮培养物。在多孔固相支持物 上，将所述细胞悬浮培养物与携带包含外源基因和选择标记的载体的根癌农杆菌培养物共 培养，所述农杆菌能将所述外源基因和选择标记稳定转移进所述细胞的基因组中。从而共 培养产生细胞群。可以从中选择出表达所述外源基因的细胞，并将其再生为转基因植物。 在一个实施方案中，所述原胚细胞衍生自、获自愈伤组织或是愈伤组织的一部分。所述多孔 固相支持物优选为膜或过滤介质，优选至少包括尼龙、硝化纤维、纤维素或玻璃纤维中的一 种。在一个实施方案中，所述固相支持物浸泡在液体培养基中。在另外一个可选实施方案 中，所述固相支持物置于合适的固体培养基上。载体可以是质粒例如Ti或Ri质粒。本发 明的方法是已知的农杆菌介导的转化方法的改进。
如果需要，可以使用本领域已知的方法将所得到的转基因(转化的)植株与感兴 趣的种质回交。本发明方法使用的植物细胞可源自任何植物，没有限制，但优选为棉花、 玉米、大豆、小麦、水稻和大麦，最优选为棉花。优选的棉花品种包括陆地棉(Gossypium hirsutum)和海岛棉(Gossypium barbadense)。其它植物，包括其它双子叶植物，也适合用 本发明的方法转化。
在本发明的方法中，所述液体培养基可以是低生长素含量的培养基(范围例如从 约0到约0. lmg/1 NAA)。除非有其他说明，在本文所述方法的培养步骤中使用的培养基可以是任何适合所述培养的培养基。在本领域有许多这样的培养基是已知的并可以获得。细 胞选择通过化学或遗传学方法进行，可以包括使用报道构建体作为选择标记。这些选择方 法在本领域是已知的。在一个优选的实施方案中，所述报道构建体组成型表达绿色荧光蛋 白。特别优选的报道构建体是PPZP111-35S :GFP。
在一个实施方案中，所述原胚细胞通过对植物种子进行灭菌、使所述种子萌发以 生成植物组织、从所述植物组织获得外植体、以及从所述外植体诱导形成愈伤组织获得。所 述种子可在漂白剂溶液中灭菌，优选包含约30 %漂白剂的溶液。可在MS培养基上使所述种 子萌发，萌发时间大概需要约4-14天。所述外植体优选为根或茎尖(shoot tip)。
本发明的方法进一步包括诱导愈伤组织形成和在固体培养基上起始体细胞胚发 生，这段过程需要约一到三个月的时间。此外，这些方法进一步包括诱导愈伤组织分化生成 原胚组织，这样的分化可优选地在不含激素的固体培养基上经过一段长到足够生成原胚组 织的时间进行，所述原胚组织优选在低生长素含量的液体培养基或一系列液体培养基中悬 浮、维持和繁殖。
上述悬浮培养材料优选在具有不同生长素含量和氮源的一系列新鲜培养基中定 期传代培养，优选的间隔时间为约3天到约30天。上述使用的液体培养基优选含有补充 了低浓度的生长素的MS盐和维生素B5，所述低浓度的生长素优选为约0-0. lmg/1 NAA和 /或约0-lmg/l毒莠定。如果提供，可选择的氮源优选为氨基酸，例如谷氨酰胺和/或天冬 酰胺，优选的浓度为约0. l-5g/l。上述固体或液体培养基优选pH为约5. 8-约6. 5，优选约 6. 0-约6. 4。悬浮培养物可在约26-约32°C、光照周期为约16个小时的条件下于振荡平台 上维持。
本文描述的共培养可进一步包括在低磷酸盐液体培养基中使所需农杆菌菌株生 长，所述培养基优选补充了合适浓度的毒力诱导试剂的MinAB培养基，使所述农杆菌菌株 生长至密度优选为约0. 1-0. 5个0D600单位，从而提供具有预诱导的毒力的农杆菌。所述培 养物可以在有益于T-DNA受体细胞良好生长并增强农杆菌毒力表达的液体培养基中重建。 或者，农杆菌菌株可通过在农杆菌基因组或农杆菌中的Ti或Ri质粒载体中插入上述基因 而工程化为组成型表达活性virA突变体。
悬浮培养材料可在液体培养基中重建，所述液体培养基适于表达农杆菌vir基因 并在多孔固相支持物如膜或过滤介质上与上述制备的农杆菌培养物混合。这种混合物可 在持续光照下培育约1-5天。在一个实施方案中，所述细胞或愈伤组织被转移至补充了合 适的抗生素以抑制未转化植物细胞和农杆菌细胞生长的不含激素的培养基。所述多孔固相 支持物可以是如所描述的膜或过滤介质，并且可以平铺在合适的固体培养基上或浸在合适 的液体培养基中，所述培养基优选含有补充了维生素B5和作为氮源的蔗糖和/或丙三醇 的MS盐或MinAB盐。这些培养基优选pH为约5. 7-约6. 5，优选约5. 7-约5. 9。优选在约 18-26°C、在稳定的或持续光照下进行共培养。
农杆菌培养物可以是新鲜制备的或低温保存在例如约0-20% DMS0中、约0_90% 丙三醇中或约0-5M山梨糖醇或其任意组合中。
一方面，本发明还提供了从原胚悬浮培养材料再生完整植株的方法。这些方法包 括诱导所述悬浮培养材料再次进入胚发育和胚增殖阶段，所述诱导通过将预先与农杆菌共 培养或未与农杆菌共培养的悬浮培养的材料置于不含激素并增加了 KN03的基于MS的培养
8基中，并例如每隔约3-4周在相同组分的培养基中定期传代一段足以产生前球状胚到球状 胚的时间进行。同样，可以例如约每隔3-4周进行进一步的定期传代，所述传代在增加了 謂03并补充了氨基酸的固体培养基中，优选基于MS的培养基中培养约4-12周进行，所述氨 基酸优选为浓度约0. l-5g/l的谷氨酰胺和天冬酰胺。接下来可以在合适的培养基中诱导 形成根和真叶，然后将所得到的小植株转移到土罐中产生开花植物。此处所述的培养基可 以补充合适的抗生素以抑制进行共培养时未转化的细胞和农杆菌细胞的生长。所述传代可 在液体培养基、带有支撑膜的液体培养基、固体培养基或其它合适的培养基中进行。这些培 养基的PH优选约5. 7-约6. 5，更优选约6. 0-约6. 4。此处涉及的棉花或其它植物细胞、体 细胞胚和小植株优选在约25-32°C、光照周期为约16小时条件下培养。可以不经过预先冲 洗而选择共培养的材料。
本发明还提供一种方法，作为本文已描述的方法的扩展和补充，所述方法用于拯 救不育植株和加速产生商品化品种，该方法包括用来源于同品种或特定感兴趣的种质的合 子种子的花粉进行植株(包括雄性不育株)的人工授粉。在需要或必要时，可以在后续的 世代中进行持续的回交。
在优选的方法中，所述农杆菌包括virA基因变体。所述virA基因变体可整合到 农杆菌的基因组或掺入载体中。
在已描述的方法中，可以通过加入细胞分裂素来促进细胞再生为植株。尤其对于 棉花来说，所述细胞分裂素优选是玉米素或其衍生物。此外，在一个实施方案中，原胚植物 细胞在包含低浓度的2，4-D和细胞分裂素的固体培养基上进行起始培养。所述原胚细胞也 可以在不含激素的液体培养基和/或低生长素含量的液体培养基中增殖。
将外源基因导入农杆菌而使其可以稳定地转移进与所述农杆菌接触的植物或 植物组织中的技术是本领域已知的。优选使用所谓的“去毒(disarmed)”农杆菌菌株或 Ti质粒，即，其中负责野生型农杆菌导致的冠瘿病的肿瘤特征形成的基因已被除去或灭 活的菌株或质粒。在文献中可见大量去毒农杆菌菌株的实例(例如，pAL4404、pEHAlOl 和pEH105 (Walkerpeach & Veltern，1994))。更优选使用所谓二元载体系统，例如 5油1切吐00汁等1990，1995所描述的。二元载体系统允许在大肠杆菌中操作携带要导入植 株中的外源基因的质粒，这使得载体构建的过程更易于进行。
类似地，载体构建(包括构建包含希望导入植物的外源基因的嵌合基因)可用本 领域熟知的技术进行。嵌合基因应包含在希望表达的宿主中有活性的启动子。例如，有利 的是具有一系列选择标记，以便在转化过程的不同阶段选择转化的细胞。将选择标记(例 如赋予抗生素如卡那霉素、头孢噻肟或链霉素抗性的基因)与在细菌中有活性的启动子相 连，可使得能选择出含有所述标记的细菌(即转化子)。与植物活性启动子(如CaMV35S启 动子或T-DNA启动子如NPT II N0S启动子)连接的另外一种选择标记可使得能选择转化 的植物细胞。希望导入植物细胞的外源基因应包含与编码序列功能性相关的植物活性启动 子，从而该启动子在转化的植物中驱动所述基因的表达。同样，植物活性启动子如CaMV 35S 启动子、NPT II N0S启动子或很多其他组织特异性启动子是本领域熟知的，且选择合适的 启动子属于本领域常识。
本发明的方法可用于产生表达任意数目外源基因的转基因植物，并且不限于所选 的基因。所需外源基因的选择取决于研究者的目的，在本领域中已知许多可用于本发明的
9所需基因(例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素基因家族、除草剂抗 性基因如赋予草甘磷抗性的莽草酸合酶基因、美国专利5，188，642、或赋予2，4_ 二氯苯氧 乙酸(2,4-D)抗性的2，4-D单加氧酶基因(Bayley等，1992)、雄性不育基因如美国专利 5，741，684 (Fabijanski等)的反义基因、或甚至是美国专利5，723，765 (Oliver等)描述的 精细作物保护系统)。
正如本文表明的，本发明特别提供了使用不同悬浮起始培养和维持培养过程的方 法。作为一个非限制性例子，从成熟棉花种子切下的根和茎尖作为外植体在细胞分裂素和 低浓度2，4-D存在下用于诱导形成愈伤组织。通过将其转移到不含激素、含有高KN03含量 的固体培养基上开启体细胞胚生成发育途径。选择的愈伤组织的悬浮培养物可以在具有 相似组分的补充了低浓度的生长素(0.01mg/l NAA)的液体培养基中进行起始培养。基于 将愈伤组织转移到液体培养基的时间，这些培养物可在早期胚发育的各个阶段进行维持培 养。如果一直使用同样的培养基，则产生的细胞培养物会暗化。然而，针对这个问题的有效 解决方案包括在四种不同培养基中轮流培养。这使得培养物经历简短的细胞分化_增殖循 环过程，这是由于氮源减少的情况下胚的发育增强特性(Davidonis和Hamilton，1983)。这 样制备的细胞培养物具有很好的发育同步性和均一的微黄色。不同细胞系的胚发生能力是 不同的。
进一步提供了促进细胞培养物再生为体细胞胚的培养基组合物，其通过加入细胞 分裂素而显著提高早期胚发育。已经发现细胞分裂素在体细胞胚生成中起着重要的作用 (Xing等，1999 ；Sagare等，2000，Tokuji和Kuriyama，2003)。然而，从未报道过其可用于棉 花的再生。已发现细胞分裂素，尤其是玉米素核糖核苷，在植物再生的早期阶段使用时，能 够显著提高体细胞胚的形成。合理使用该激素可以缩短再生为完整小植株的时间，这是由 于至球形胚阶段的胚的转化提高以及叶子的发育加快。先前，悬浮细胞的再生或者通过在 液体培养基中培养进行，或者通过将其均勻地平铺在固体培养基上进行(Finer，1988 ；EP 0317512B1, US5, 583,036).两种方法都与合子胚的天然发育环境相差极大。而且，材料需 要重复传代，因此使用平铺的愈伤组织是很繁琐的工作，并且在再生过程中生长较慢的转 化子可能会被选出。而本发明通过部分包埋进各个分区中的固体培养基中而简化了悬浮培 养的细胞/愈伤组织的处理过程，这易于传代培养物之间的物质转移，而且所述细胞如此 聚团可以防止在固体培养基中培养期间发生脱水。
已知环境pH和温度影响农杆菌的毒力。最优的毒力大约出现在pH5.7，25°C以下 (Rogowsky，等，1987 ；Fullner和Nester，1996)。本发明已经考虑了这些因素以配制与已用 于高效转化纤维状真菌的培养基不同的培养基(Bimdock等，1995 ；de Groot等，1998)，以 使植物细胞(特别是棉花)健康生长。与预诱导的培养物在约24°C下进行共培养。或者， 农杆菌菌株可工程化为表达virA突变体(McLean等，1994)。
根据前面的描述，本领域普通技术人员可最大程度地实施本发明。因此下面的实 施例只是例证性的，而不应被解释为在任何方面限制如在后面的权利要求
书中所列出的本 发明。
报道构建体，即组成型表达绿色荧光蛋白(GFP)的pPZPlll-35S :GFP(Xu等，未公 开的数据)(图1)，用于例证本发明的技术过程以及检测所述方法的有效性。正如所指出 的，本发明也可以使用其它合适的标记。[0059]实施例1
从外植体产生棉花悬浮细胞培养物
在30%漂白剂溶液中浸泡棉花种子45-90分钟灭菌。在用水彻底清洗后，种子在 28°C于水中浸润一天，然后在28°C、16小时光照条件下于SGM培养基上进一步温育4_14 天。将根切成小段(3_5mm)，并使之在SM1培养基上培养约1个月以使愈伤组织发育。或 者，可以从种子上切下胚的茎尖，用于诱导愈伤组织。将所述愈伤组织从外植体上分离，进 一步在SM1培养基上培养约1个月。为了诱导体细胞胚，将愈伤组织转移到SM2培养基上， 每隔3-4周传代到新鲜培养基上，直到获得松散结构化的微黄色或者微红色愈伤组织。将 多至200mg的分离的愈伤组织置于合适容器中(例如250ml锥形瓶或圆筒组织培养容器) 的50ml LM1培养基中，并在28°C于振荡平台(120RPM)上以16小时光照周期培养。通过 将15ml培养物(在稳定的培养物中约2ml细胞量)转移到另外容器中的35ml新鲜培养基 中对细胞/愈伤组织进行传代，典型地每隔7-14天进行。循环使用四种液体培养基(LM1、 LM2、LM3 禾口 LM4)。
实施例2
将感兴趣的基因导入到棉花细胞中
将感兴趣的基因通过农杆菌介导的T-DNA接合送递至棉花细胞中，其通过对新鲜 的经过传代的棉花悬浮培养物和携带包含目的基因和显性选择标记的合适的Ti或Ri载体 的农杆菌培养物进行共培养实现。混合物共点样于平铺在SIM1或SIM2平板上的一片多孔 膜或滤纸上，培养足以产生所需数量的转化的棉花细胞的时间。或者，可以用已浸泡过液体 培养基的3-4片滤纸代替所述固体培养基。为了获得最好的结果，使用按照描述制备的用 于纤维状真菌转化的预诱导的农杆菌培养物，尽管一般的细菌培养物也能使用(de Groot 等，1998)。
实施例3
从转化的细胞再生为转基因棉花植株
共培养后，细胞转移到补充了合适的抑制未转化的棉花细胞以及所粘附的农杆菌 细胞的抗生素的R1培养基上。也可通过可视化标记选择转化的植物细胞。共培养的棉花 细胞不需要清洗，并且可以转移到选择固体培养基如callus AsectorsO上(一般100-150/ 共培养物)。或者，每份共培养物可作为整体转移到缺乏phytagel的相同培养基中的培养 筏(culture raft)上(图7)。液体培养基中的培养通常限制在最初的3_4周。在这之后， 优选转移到固体R1培养基上。通常需要在R1培养基上进一步培养3-4周，以便获得多个 胚。如果没有看到未分化的胚，则需要在R1培养基中进一步培养。随后，将具有抗生素抗 性的球形胚阶段或更晚阶段的胚在R2培养基上培养3-4周，并重复一次。在R2培养基上 进行第二次培养时可以去除抗生素。将发育完全的胚(不带根，带有子叶)或无明显子叶 的绿色胚样组织转移到R3培养基，然后再将完整的小植株转移到R4培养基。在约3-4周 后，将小植株种植到土罐中。
实施例4
悬浮细胞培养物的制备
棉花种子(Coker 312)在30%漂白剂(Clorox)溶液中浸泡45分钟灭菌，随后用 水清洗两次，在28°C于水中浸润一天。种子进一步在28°C、16小时光照周期下于SGM培养基上培养4天。将白色的根切成小段(3-5mm)，使之在SM1培养基上培养约1个月形成愈伤 组织。将愈伤组织从外植体上分离，在同样的培养基上进一步培养约1个月。将愈伤组织转 移到SM2培养基，每隔大约3-4周传代到新鲜培养基上，直到获得松散结构化的愈伤组织。 将约200mg分离的愈伤组织放置在250ml锥形瓶中的50ml LM1培养基里，在28°C以16小 时光照周期于振荡平台(120RPM)上培养。每7-14天通过将每份15ml的培养物(在稳定 的培养物中约2ml细胞/愈伤组织量)转移到另外容器中的35ml新鲜培养基中对悬浮培 养物进行传代。在所选择的5个愈伤组织中，在四种不同培养基(LM1、LM2、LM3和LM4)中 循环进行传代培养时，有三个稳定为由各种尺寸的愈伤组织组成的旺盛生长的微黄色培养 物。在扫描电镜下检查时，所述愈伤组织显示没有或有限的胚结构(图2)。如果一直使用 单一的培养基，可发生严重的变棕或变暗现象(图3)。当将培养物S4和S5转移到固体培 养基R1上时，它们都成功地发育为体细胞胚。
实施例5
细胞悬浮培养物的制备
棉花种子在30%漂白剂(Clorox)溶液中浸泡45分钟灭菌，随后用水清洗两次，在 28°C于水中浸润一天。种子进一步在28°C、16小时光照周期下于SGM培养基上培养4天。 将白色的根切成小段(3_5mm)，使之在SM1培养基上培养1个月形成愈伤组织。将愈伤组 织从外植体上分离，在同样培养基上进一步培养约1个月。将愈伤组织转移到SM2培养基 上，每隔3-4周传代到新鲜培养基上，直到获得松散结构化的愈伤组织。将多至200mg分离 的愈伤组织放置在250ml锥形瓶中的50ml LM1培养基里，在28°C以16小时的光照周期于 振荡平台(120RPM)上培养。每7天通过将每份15ml的培养物(在稳定的培养物中约2ml 细胞/愈伤组织的量)转移到另外容器的35ml新鲜培养基中对悬浮培养物进行传代。在 所选择的3个愈伤组织中，在四种不同培养基(LM1、LM2、LM3和LM4)中循环进行传代培养 时，有两个稳定为由各种尺寸的愈伤组织组成的旺盛生长的微黄色愈伤组织。将培养物S15 和S16转移到固体培养基R1上时，它们都成功地发育为体细胞胚。
实施例6
悬浮细胞培养物的制备
棉花种子在30%漂白剂(Clorox)溶液中浸泡45分钟灭菌，随后用水清洗两次， 在28°C于水中浸润24小时。种子进一步在28°C、16小时光照周期下于SGM培养基上培养 4天。将白色的根切成小段(3-5mm)，使之在SM1培养基上培养约1个月形成愈伤组织。另 外，从灭菌种子上切下胚的茎尖，与根外植体一样用于诱导愈伤组织。一个月后，切下两种 外植体顶端的微黄色愈伤组织，在相同的培养基中再培养一个月。将愈伤组织转移到SM2 培养基，每3-4周传代到新鲜培养基上，每3-4周传代到新鲜培养基上，直到获得松散结构 化的愈伤组织。将约200mg分离的愈伤组织放置在250ml锥形瓶中的50ml LM1培养基里， 在28°C以16小时的光照周期于振荡平台(120RPM)上培养。每7天通过将每份15ml的培 养物(在稳定的培养物中约2ml细胞/愈伤组织的量)转移到另外容器的35ml新鲜培养 基中对悬浮培养物进行传代。所有7个所选择的愈伤组织均稳定为旺盛生长的微黄色愈伤 组织。
实施例7
细胞分裂素对早期胚发育的影响
12[0079]将约0. lg的悬浮培养的愈伤组织平铺在补充了含有lmg/1 6BA、2IP或玉米素核 糖核苷的0. 01mg/l NAA的R1培养基上。培育5周后，记录球形胚阶段或更晚阶段的胚的数 目。在两种测试的培养物(S5和S 16)中，玉米素核糖核苷的处理使胚产量显著增加(图 4)。
实施例8
细胞分裂素对早期胚发育的影响
将原胚愈伤组织置于含或不含lmg/1玉米素核糖核苷的R1培养基中。在含玉米素 核糖核苷的R1培养基上培养愈伤组织1-3个月。可观察到在玉米素核糖核苷处理的平板 上胚数目和尺寸显著增加，而且在继续暴露于玉米素核糖核苷时，其效果更加显著(图5)。
实施例9
用诱导后的农杆菌培养物转化悬浮培养物
通过电穿孔，将二元T-DNA载体pPZPl 11-35S :GFP导入根癌农杆菌菌株AGL1中。 用IM培养基将菌株的饱和培养物稀释5倍，然后在28°C下培养6个小时，直到达到约0.3个 OD600单位。将约0. 5ml的悬浮培养物S5以及在LM1、LM2、LM3或LM4上培养的S5与0. 2ml 农杆菌培养物混合，并共点样于平铺在补充了 100 u M乙酰丁香酮的R1培养基上的Hybbond N膜(Amersham Pharmacia)上。在24°C、持续光照下共培养3天后，用悬浮培养基(例如， 含100mg/l卡那霉素和450mg/l头孢噻肟的LM1)冲洗尼龙膜上的愈伤组织。将整个膜转 移到补充了 100mg/l卡那霉素和300mg/l头孢噻肟的R1或R2培养基上，在28°C以16小时 光照周期培养。一个月后可见GFP阳性愈伤组织。将剩余的农杆菌培养物分成每份0. 5ml, 并且加入等体积的14% DMS0。在-80°C下冷冻保存细菌储备物，备用。
实施例10
悬浮培养物的转化
在使用前，将冷冻的AGL1培养物试管解冻后离心收集细菌细胞。用0.5ml C1培 养基(pH 5.7)重悬细菌团，然后与0.5ml (约0.2g细胞量)细胞悬浮培养物混合，共点样 于平铺在 CP1 培养基(pH 5.7)上的 Hybond-N 膜(Amersham Pharmacia)或 Whatman 4 滤 纸上。一个膜上可同时进行多个(3-4)独立的共培养(图6)。共培养后，转移细胞/愈伤 组织(没有清洗)至补充了 100mg/l卡那霉素和200mg/l头孢噻肟的R1培养基，在28°C以 16小时光照周期培养。每个共培养分成多至160块区域(sector)，每块区域代表单一的大 型愈伤组织或一小簇微型愈伤组织(图7A)。或者，将整个共培养物转移到补充了 100mg/l 卡那霉素和200mg/l头孢噻肟的LM1培养基上的培养筏上(图7B)。在选择培养基上第5 天就可以看到可分辨的绿色荧光点(图7C)。在R1培养基中培养4周后，将卡那霉素抗性 区域分别转移至补充了同样抗生素的固体R1培养基上。同时，将液体培养的愈伤组织转移 至固体选择培养基R1。在共培养后的不同时间点，在荧光显微镜下观察每个区域的绿色荧 光。大约在一个月后出现GFP阳性体细胞胚(图8)。共培养3个月后，在每个共培养物中 发现多至38块区域含有绿色荧光阳性胚。GFP呈阳性但尚未形成体细胞胚的区域比上述数 字高出几倍。两种类型的共培养支持物都取得了满意的结果，总结如表1所示。
13

实施例11
用pPZPlll_35S :GFP构建体转化悬浮培养物
将冷冻的携带pPZPlll-35S :GFP的AGL培养物的试管解冻，然后离心收集细菌细 胞。将细胞团重悬在Cl(pH 5.7)中。用C1培养基冲洗悬浮培养物(S4，S5和S16)。约 0. 5ml培养物与0. 4ml农杆菌悬浮液混合，共点样于平铺在CP1培养基(pH 5. 7)上的尼龙 膜上。共培养后，将愈伤组织(没有清洗)转移至补充了 100mg/l卡那霉素和200mg/l头 孢噻肟的R1培养基上，在28°C以16小时光照周期培养。将每个共培养物分成多至160块 区域，每块区域代表单一的大型愈伤组织或一小簇微型愈伤组织。或者，将整个共培养物转 移至补充了 100mg/l卡那霉素和200mg/l头孢噻肟的LM1培养基上的培养筏上。在选择培 养基中两个月后，将卡那霉素抗性区域转移至补充了含有相同抗生素的lmg/1玉米素核糖核苷的新鲜的R1平板上，继续培养4. 5周。将卡那霉素抗性愈伤组织转移至补充了 50mg/l 卡那霉素和200mg/l头孢噻肟的R2培养基上。在不含抗生素的R2培养上这样重复两次，选 择有可能在第一次在R2培养基上培养时就会出现的大的、生长旺盛的胚或绿色愈伤组织， 并转移至R3培养基上。胚可能发芽并长出根和真叶(图9A)。有趣的是，玉米素处理使得 许多没有子叶的不正常胚和甚至是绿色组织(如图9B所示)发育出芽。经常情况下，长出 多个芽(图10)。长出真叶的小植株在3-4周后更茂盛，并继续在R4培养基中培养使叶和 根进一步发育(图11)。将带有6-8片叶子的小植株转移到土罐中，大约在共培养后的7-8 个月，植株开始开花(图12)。约77%的成株是GFP荧光阳性(图13)。从每一共培养物可 生成多达26株健壮的植株。用Southern印迹分析分析了其中18个推定的转化体，其中17 个呈GFP转基因阳性(95% )，7个含有单一转基因(39%)。具体的转化结果如表2所示。
16
302-sSTP逛 IP适赇架 IE I 曰/Ms l 如"O02N.S 5 IMI03 镜半 lMsos 悖釦 602,s ■趣 5 sis^ I/§UI_ , 練諾J1JL1 102 脉钿.:CJ00s-5 。替凶s 塑S3i’te紲y<-—链刼</^韶长琳喊## *皿籁域凶粥^钋籟铝悴銨“划
寸
-SSK09IS
S
1
I-i
ON 00
CN CO
091
§ r-<
实施例
养培养基的PH的影响
前制备的农杆菌储存液离心收集菌体，分别用pH 5. 2、5. 7、5. 9和6. 2的C1
悬浮细胞与0. 4ml农杆菌悬浮液混合，然后共培养于相应的固体培养基
共培 将先
2)上的尼龙膜上。每种条件进行3组共培养。在R1选择培养基上培养
约 0. 2mg pH 5. 2-6.
18个月后，记录显示GFP荧光区域的数目。使用pH大于5. 2的培养基获得显著更好的结果。 当C1的pH分别为5. 2,5. 7和6. 2时，呈GFP荧光阳性的愈伤组织区域的比率平均分别为 71%、81%禾口 83%0
实施例13
共培养方法的比较
为了确定本发明的方法获得高效转化率的因素，我们使用基本上如先前公开的方 法(US5，583，036)转化我们的悬浮细胞培养物。在LB培养基中制备T-DNA供体(携带 PPZP111-35S :GFP的AGL1菌株)。离心收集细菌细胞，用补充了 lmg/1 NAA的MS培养基重 悬浮至0. 5个0D600单位。将约0. 2g悬浮培养物(S5和S16)与在锥形瓶中的2ml新鲜的 农杆菌培养物混合，于28°C下放置两个小时以使农杆菌细胞粘附到悬浮细胞上。在去除液 体培养基后，向烧瓶中加入10ml补充了 lmg/1 NAA的MS培养基。在振荡平台(lOOrpm)上 培养细胞18个小时。用MS培养基冲洗悬浮细胞(两次)，分区域置于R1选择培养基上。 在平行试验中，如实施例9所述，制备相同的新鲜未冷冻的农杆菌菌株。如实施例10所述， 共培养S5和S16培养物。在R1选择培养基上培养30天后，记录体细胞胚的数目。在使 用我们的方法进行共培养后，约64% (S5)和83% (S16)的愈伤组织区域呈GFP荧光阳性， 而当在振荡的锥形瓶中的液体培养基中进行共培养后，相应比率降为只有(S5)和13% (S16)(图14)。使用本发明的共培养方法，很明显卡那霉素抗性区域长的更大，其中发育的 胚也更多。
实施例14
转基因植物繁殖能力的恢复
通过本文公开的方法获得了能自花授粉的转基因植物，尽管在花粉发育中可见到 某些缺陷(图15)。因此，优选人工授粉产生种子。在用源自种子的植株的花粉进行授粉 时，源自S16的绝大多数植株都是能育的(图15)。这是有利的，因为经常需要回交以生产
商品化品种。[0105]本文所用的简写和术语[0106]MS 盐(Murashige and Skoog,1962)[0107]332. 02mg/l CaCl2[0108]170mg/l KH2P04[0109]1900mg/l KN03[0110]180. 54mg/l MgS04[0111]128. 4mg/lNaH2P04[0112]1650mg/lNH4N03[0113]0. 025mg/l CoC12.6H20[0114]0. 025mg/l CuS04. 5H20[0115]36. 7mg/l FeNaEDTA[0116]6. 20mg/l H3B04[0117]0.83mg/l KI[0118]16. 9mg/l MnS04.H20[0119]0. 25mg/l Na2Mo04. 2H20[0120]8. 60mg/l ZnS04. 7H20
B5维生素
100mg/l 肌醇
lmg/1 烟酸
lmg/1盐酸吡哆醇，
10mg/l盐酸硫胺
SGM 半浓度MS盐和半浓度B5维生素，0. 02mg/l NAA, 0. Img/1MET (多效 trizazole), 5g/l 葡萄糖，2g/l phytogel, pH 6. 0
SMI :MS 盐，B5 维生素，0. lmg/1 激动素，0. 05mg/l 2，4_D，30g/l 葡萄糖，2g/l phytogel, pH 6. 2
SM2 :MS 盐，B5 维生素，1.9g/l KN03，30g/l 葡萄糖，2. 5g/l phytogel, pH 6.4
LM1 :MS 盐，B5 维生素，1. 9g/l KN03，0. 0lmg/1 NAA，30g/l 葡萄糖，pH 6. 4
LM2 不含 NH4N03 的 MS 盐，B5 维生素，1. 9g/l KN03,0. Olmg/INAA, 30g/l 葡萄糖， lg/1谷氨酰胺，0. 5g/l天冬酰胺，
PH 6. 4
LM3 :MS 盐，B5 维生素，0. 05mg/l NAA，30g/l 葡萄糖，pH 6. 4
LM4 :MS 盐，B5 维生素，0. 0lmg/1 NAA，0. 5mg/l 毒莠定，30g/l 葡萄糖，pH 6. 4
C1
2. 05g/l K2HP04
1. 45g/l KH2P04
0. 6g/lMgS04-7H20
0. 5g/l(NH4)2S04
0. 5g/l NH4N03
0.01g/l CaCl2
2g/l 葡萄糖
0. 5mg/lZnS04-7H20
0. 5mg/l CuS04-5H20
0. 5mg/l H3BO3
0. 5mg/lMnS04-H20
0. 5mg/l NaMb04-2H20
lmg/1 FeS04
B5维生素
0.0 lmg/1 NAA
0. 5mg/l 毒莠定
40mM MES
0.5% 丙三醇
0-100 iiM 乙酰丁香酮
pH5. 7-6. 0
CP4 :C1，力口 4g/l phytogel
200156]R1 :MS 盐，B5 维生素，1.9g/l KN03，30g/l 葡萄糖，pH 6. 4，2. 8g/lphytogel。
0157]R2 不含NH4N03的MS盐，B5维生素，1. 9g/l KN03，30g/l葡萄糖，lg/1谷氨酰胺， 5g/l天冬酰胺，pH 6.4,2. 8g/l phytogel
0158]R3 :MS, B5 维生素，30g/l 葡萄糖，0. 01mg/l NAA，3g/l phytogel, pH6. 4
0159]R4 半浓度MS，B5维生素
0160]MinAB
0161]2. 05g/l K2HP04
0162]1. 45g/l KH2P04
0163]0. 6g/l MgS04-7H20
0164]0. 3g/l NaCl
0165]0. 5g/l(NH4)2S04
0166]0. 5g/l NH4N03
0167]0.01g/l CaCl2
0168]2g/l葡萄糖
0169]0. 5mg/l ZnS04-7H20
0170]0. 5mg/l CuS04-5H20
0171]0. 5mg/l H3BO3
0172]0. 5mg/l MnS04-H20
0173]0. 5mg/l Mb04-2H20,
0174]lmg/1 FeS04
0175]pH 7. 0
0176]IM
0177]2. 05g/l K2HP04
0178]1. 45g/l KH2P04
0179]0. 6g/l MgS04-7H20
0180]0. 3g/l NaCl
0181]0. 5g/l(NH4)2S04
0.5g/lnh4no3[0183]0.Olg/1CaCl2[0184]0.5mg/1ZnS04--7H20[0185]0.5mg/1CuS04--5H20[0186]0.5mg/1h3bo3[0187]0.5mg/1MnS04--h2o[0188]0.5mg/1NaMBOr2H20,[0189]lmg/1FeS04
0190]0.5%丙三醇
0191]2g/l葡萄糖
0192]100-200 u M 乙酰丁香酮
0193]40mM MES
21[0194]pH 5. 7
参考书目
Ashby 等(1988)，T. Bacteriol.，170 :4181_4187 ；
Bayley 等(1992)，Theoretical and Applied Genetics,83 :645_649 ；
Bolten 等(1986)，Science,232 :983_985 ；
Bundock 等(1995)，EMBO T. , 1995，14 :3206_14 ；
Chair, H.等(1997)，Kasetsart T. , vol. 33，pp. 149-156 ；
Chen 和 Winans (1991), T. Bacteriol. , 173 :1139-1144 ；
Cousins, Y. L.等(1991)，Aust. T. Plant Physiol. , 18 481-494 ；
Davidonis, G. H.禾口 Hamilton，R. H. (1983)，Plant Sci. Lett. , 32 :89_93 ；
de Groot 等(1998)，Nat. Biotechol. , 16 :839_42 ；
Fiher, J. (1988)，Plant Cell Rep. ,7 :399_402 ；
Finer 禾口 McMullen(1990)，Plant Cell Reports, i :586_589 ；
Firoozabady 等(1987)，Plant Molecular Biol. ,10 :105-116 ；
Fullner 和 Nester (1996) , T. Bacteriol. , 178 :1498-504 ;
Hansen 等(1994)，Proc.Nat' 1 Acad. Sci. ,91 :7603_7607 ；
Hoshino 等(1988)，Plant Biotech. ,15(I). 29-33 ；Levee 等(1999)，Molecular Breeding, 5 :429_440 ；
McCabe 禾口 Martinell(1993)，Bio/Technology 11 :596_598 ；
McLean (1994)，T. Biol. Chem.，269 :2645_2651 ；
Murashige 禾口 Skoog(1962)，Physiol. Plant, 15 473 ；
Murray 等(1993)，Transgenic Plants, vol. 2，pp.153-168 ；
Otani 等(1998)，Plant Biotech, vol. 15，pp. 11—16 ；
Owens 等(1988)，Plant Phvsiol.，vol. 88，pp. 570—573 ；
Piers 等(1996). PNAS, 93 1613~1618
Rogowsky 等(1987)，J Bacteriol. 169 :5101_12 ；
Sagare 等(2000)，Plant Sci. 160 :139-147 ；
Scheeren-Groot 等(1994)，J.Bacteriol. 176 6418-6246 ；
Sheikholeslam 和 Weeks (1987)，Plant Mol. Biol.，vol. 8，pp. 291—298 ；
Schilperoort,R. A.等(1990),Process for the incorporation of foreign DNA into the genome of dicotyledonous plants, U.S.Patent No. 4, 940, 838 ；
Schilperoort, R. A.等(1995),Process for the incorporation of foreign DNA into the genome of dicotyledonous plants, U.S.Patent No. 5, 464, 763 ；
Stachel 等(1985)，Nature,318 :624_629 ；
Still 等(1976)，J. Amer. Soc. Hort. Sci.，vol. 101，pp. 34-37 ；
Tokuji 和 Kuriyama(2003)，J. Plant Physiol. 160 133-41 ；
Trolinder, N.L.禾口 Goodin，J. E. (1987)，Plant Cell Reports 6 :231_4 ；
Umbeck 等(1987)，Bio/TechnoloRY 5 :263_266 ；
Veluthambi 等(1989)，J. Bacteriol. 171 :3696_3703 ；[0231]Vernade 等(1988)，T. Bacteriol 170 -.5822-5829 ；
ffalkerpeach, C. R.和 Velten，J. (1994) Plant Mol. Biol. Manual. B1 1-19.
Xing, D.等(1999)，Chin. T. Biotechnol. 15 :59_64。
23
权利要求
一种生产转基因棉花植物的方法，所述方法包括a)提供原胚棉花细胞；b)在液体培养基中培养所述原胚细胞以产生细胞悬浮培养物；c)提供携带包含外源基因和选择标记的载体的经预诱导的根癌农杆菌培养物，所述农杆菌能将所述外源基因和选择标记稳定转移进植物细胞的基因组中，其中所述对根癌农杆菌的预诱导是毒力预诱导；d)将所述细胞悬浮培养物的一部分与所述农杆菌培养物的一部分混合；e)在持续光照的条件下，将所述细胞悬浮培养物与所述农杆菌培养物的混合物在与共培养培养基接触的多孔固相支持物上共培养1-5天，由此产生其中一些细胞用所述外源基因和选择标记转化的细胞群，其中所述共培养培养基不包含来自悬浮培养物的细胞；f)从所述细胞群中选择表达所述外源基因的细胞；g)通过体细胞胚发生将所选择的细胞再生为转基因棉花植物。
2.权利要求
1的方法，其中所述原胚细胞衍生自愈伤组织。
3.权利要求
1的方法，其中所述固相支持物选自膜和过滤介质。
4.权利要求
1的方法，其中所述多孔固相支持物包括尼龙、硝化纤维、纤维素和玻璃纤 维中的至少一种。
5.权利要求
1的方法，其中所述棉花选自由陆地棉(Gossypiumhirsutum)和海岛棉 (Gossypium barbadense)组成的一组。
6.权利要求
1的方法，其中所述农杆菌的预诱导通过在毒力诱导试剂的存在下培养所 述农杆菌来进行。
7.权利要求
1的方法，其中所述农杆菌的预诱导通过培养组成型表达活性virA突变基 因的农杆菌来进行。
8.权利要求
1的方法，其中所述原胚棉花细胞如下获得 从棉花植物获得外植体；从所述外植体诱导愈伤组织形成；和 从所述愈伤组织产生原胚组织。
9.权利要求
8的方法，其中所述原胚组织通过启动愈伤组织的体细胞胚发生而从愈伤组织产生。
10.权利要求
8的方法，其中所述原胚组织通过诱导愈伤组织的分化而从愈伤组织产生。
11.权利要求
8的方法，其中所述外植体如下获得 对棉花种子进行灭菌；将所述种子萌发以生成用作外植体的植物组织。
12.权利要求
11的方法，其中所述植物组织是根或茎尖。
13.权利要求
1的方法，其中所述固相支持物通过浸泡在液体共培养培养基中而与共培养培养基接触。
14.权利要求
1的方法，其中所述固相支持物通过置于固体共培养培养基上而与共培养培养基接触。
15.权利要求
1的方法，其中步骤(e)中的共培养培养基包含MinAB盐、B5维生素，乙酰丁香酮，葡萄糖和甘油。
16.权利要求
1的方法，其中步骤(e)中的共培养培养基包含MS盐、B5维生素，乙酰丁 香酮，葡萄糖和甘油。
17.权利要求
1的方法，进一步包括将所述转基因棉花植物与感兴趣的棉花种质回交。
专利摘要
本发明提供了通过农杆菌(Agrobacterium)介导的将T-DNA接合到悬浮培养的细胞或愈伤组织的高效植物转化方法。本文描述的方法使用膜或过滤介质(filter)作为多孔固相支持物，用于T-DNA供体和受体的共培养。
文档编号C12N15/82GKCN1946849 B发布类型授权 专利申请号CN 200480042792
公开日2010年10月13日 申请日期2004年4月20日
发明者纪良辉, 蔡林 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (3),