专利名称:生产在无血清的培养基悬浮培养中稳定的a549细胞系的方法
发明领域本发明涉及在培养物中生长细胞和使用所述细胞生产病毒的方法。
发明背景在开发用于生产病毒载体的悬浮方法中有两个主要障碍。一个障碍是在保持细胞接种物的长期培养中的困难。第二个障碍是一旦将生产细胞保持在悬浮环境中，病毒生产力倾向于显著减小。
使A549细胞适应于静止培养中的无血清培养基的方法是本领域已知的。例如，在Siegfried等人，(Siegfried，等人，(1994)J.Biol.Chem.269(11)8596-8603)中，使A549细胞系适应于静止培养中的无血清培养基。在该方法中，首先在一个月的时间段内使A549细胞适应含有1％胎牛血清的基本Eagle氏培养基。接近汇合时，将这些A549细胞单层用盐水洗涤并置于无血清的培养基(称作R0培养基)中，该培养基是补加硒(30nM)和谷氨酰胺(2mM)的RPMI1640无酚红培养基。在适应R0培养基期间(花费约1个月)，出现没有血清时存活的集落，并且其最终形成贴壁细胞和成簇漂浮的细胞的混合物。将适应无血清和生长因子的培养基的细胞称作A549-R0。A549-R0细胞在不存在任何血清或加入的生长因子情况下繁殖2年以上。A549-R0细胞保持在高细胞密度(5×105个细胞/ml)并且每14天以1∶2进行传代培养。A549-R0细胞具有8到10天的倍增时间，且亲代A549细胞具有30小时的倍增时间。A549-R0细胞以比亲代A549细胞低得多的速率生长，作为贴壁细胞和以大细胞团或者簇漂浮的细胞的混合物存在，以静止培养生长并且对于最佳生长需要高细胞密度。
A549细胞系在历史上已经作为贴壁培养物或者静止培养物繁殖以用以生产病毒载体。本发明提供了在A549悬浮培养中生产病毒载体的新方法。
发明概述本发明提供了在无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中稳定的适应的A549细胞系。在本发明的一个实施方案中，所述适应的A549细胞系具有鉴定为美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号PTA-5708的细胞系的特征。在本发明的另一实施方案中，所述适应的A549细胞系是鉴定为美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号PTA-5708的细胞系。
本发明还提供了使A549细胞适应无血清且无动物材料的培养基悬浮培养的方法，其包括步骤(a)在贴壁培养中使细胞从含有血清的培养基断奶(weaning)到最终血清浓度为2.5％到低于1.25％(例如，1.25％到0％)的培养基；(b)将细胞引入悬浮培养；(c)监控细胞聚集(例如，每个团块的细胞数；细胞聚集的程度；细胞团块大小的分布)；(d)除去细胞团块；和(e)继续使悬浮培养中的细胞断奶到没有血清和/或任何动物来源的其他组分的培养基。用于该适应方法的A549细胞(即，亲代细胞)可以是ATCC株系CCL-185。
本发明包括生产在无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中稳定的适应的A549细胞系的方法，其包括步骤(a)在贴壁培养中使细胞从含有血清的培养基断奶到最终血清浓度为2.5％到低于1.25％(例如，1.25％到0％)的培养基；(b)将细胞引入悬浮培养；(c)监控细胞聚集(例如，每个团块的细胞数；细胞聚集的程度；细胞团块大小的分布)；(d)除去细胞团块；(e)继续使悬浮培养中的细胞断奶到没有血清的培养基；和(f)以无血清和无动物材料的培养基悬浮培养来培养细胞。此外，本发明可以包括步骤(e)或步骤(f)后冷藏细胞。在再一个实施方案中，冷藏的细胞系在无血清且无动物材料的培养基条件下或者含有血清的培养基条件下冷冻。该方法还可以包括在0℃或者更低温度保存细胞。
本发明提供了生产病毒的方法，其包括步骤(a)培养在无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中稳定的适应的A549细胞系的A549细胞；(b)用病毒(例如，腺病毒，如CRAV)接种细胞；和(c)温育所接种的细胞。该方法还可以包括步骤(a)后且在步骤(b)前将所述培养基与新鲜培养基交换的步骤。该方法还可以包括在步骤(b)后向培养基加入氯化钙和/或将培养基与加入或不加入氯化钙的新鲜培养基交换(例如，通过灌注)的步骤。该方法还可以包括步骤(c)后冷冻细胞的步骤。此外，该方法可以包括步骤(c)后收获病毒的步骤。该方法可以包括从细胞和培养基收获病毒。
在本发明的一个实施方案中，适应的A549细胞系在无血清且无动物材料的悬浮培养中显示出至少137代的持续生长和稳定的病毒生产力。在本发明的另一实施方案中，适应的A549细胞系在无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中显示出至少6个月的持续生长和稳定的病毒生产力。
在本发明的一个实施方案中，病毒是腺病毒。在另一实施方案中，腺病毒是条件复制的腺病毒。在再一个实施方案中，病毒是重组病毒。在另一实施方案中，所述重组病毒携带异源基因。
在本发明的一个实施方案中，在无血清且无动物材料的悬浮培养中稳定的所适应的A549细胞系在接种腺病毒时的A549细胞浓度为1.8×106个细胞/ml到2.4×106个细胞/ml。在另一实施方案中，在无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中稳定的所适应的A549细胞系的A549细胞在接种腺病毒时来自晚期指数生长期中的培养物。在另一实施方案中，接种的腺病毒的量为1×108个病毒颗粒/ml培养物。在本发明的再一个实施方案中，接种时腺病毒颗粒与A549细胞的比率为(40到60)∶1。
在本发明的一个实施方案中，对于生产病毒的方法，在无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中稳定的所适应的A549细胞系的A549细胞来自冷藏的细胞系。在再一个实施方案中，冷藏的细胞系在无血清且无动物材料的培养基条件下或者在含有血清的培养基条件下冷冻。
本发明的范围还提供了生产腺病毒的方法，其包括步骤(a)在贴壁培养中使细胞系中的A549细胞从含有血清的培养基(例如，含有10％血清(例如，胎牛血清))断奶到最终血清浓度为2.5％到低于1.25％(例如，1.25％到0％)的培养基；(b)将细胞引入悬浮培养；(c)监控培养物中的细胞聚集(例如，每个团块的细胞数；团块的大小；细胞聚集的程度；细胞团块大小的分布)；(d)除去细胞团块；(e)继续使悬浮培养中的细胞断奶到没有血清和/或任何动物来源的组分的培养基；(f)浓缩细胞；(g)将培养基与补加冷冻保护剂的培养基交换；(h)冷冻细胞(例如，冷藏细胞)；(i)将细胞保存在0℃或者更低的温度下；(j)将细胞重构到无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养；(k)增殖细胞到晚期指数生长期；(l)将培养基与新鲜培养基(例如，无血清并且无动物材料的培养基)交换；(m)用腺病毒接种细胞；(n)向培养物加入氯化钙；(o)温育接种的细胞；(p)将培养基与新鲜培养基(例如，无血清并且无动物材料的培养基)交换；(q)向培养物加入氯化钙；(r)温育细胞；和(s)收获腺病毒。步骤(f)-(j)、(l)、(n)、(p)、(q)和(s)是任选的。
发明详述本发明提供了生产腺病毒(例如，在悬浮A549细胞中)的经济且容易的方法，其没有在血清或者动物来源的其他培养基组分的存在下与受感染细胞生长相关的问题。
产生适应的A549细胞系本发明包括使A549细胞系适应在不存在血清或者来自动物来源的组分的物质时生长以产生细胞系的方法，所述产生的细胞系当用腺病毒感染时显示出悬浮培养中的持续生长和稳定的病毒生产率。通常，通过如下步骤来使A549细胞适应，(a)在贴壁培养或者静止培养中，使细胞从含有血清的培养基(例如，含有10％血清的培养基)逐渐断奶到血清终浓度为2.5％到1.25％，或者2.5％到0.6％，或者2.5％到0.5％，或2.5％到0.4％，或2.5％到0.3％，或2.5％到0.2％，或2.5％到0.1％，或2.5％到0.05％，或2.5％到0的培养基；(b)将细胞置于振荡、摇动、搅动或者搅拌的容器中进行悬浮培养；(c)测量细胞聚集或者监控培养物中细胞聚集的程度；(d)除去细胞团块(通过本领域已知的任意方法)；和(e)继续使悬浮培养中的细胞断奶到没有血清或者任何动物来源的其他培养基组分的培养基。优选地，在步骤(b)、(c)和(e)中不断振荡、摇动、搅动或搅拌细胞。通常，完成适应过程需要3到6周。
通常，所适应的细胞在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中稳定至少137代或6个月(即，细胞在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中表现出持续生长和稳定的病毒生产率)。同样，所适应的细胞在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中的倍增时间为亲代A549细胞在含有血清的培养基中静止培养的倍增时间的0.8到2.9倍。例如，通常，适应的A549细胞在无血清并且无动物材料的培养基中的倍增时间为24到88小时，而亲代A549细胞在含有血清的培养基中并且静止培养的倍增时间为30小时。在适应的A549细胞系无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中，总的细胞群体是悬浮的。在一个实施方案中，99％以上的适应的A549细胞是悬浮的(例如，100％的细胞是悬浮的，100％的细胞不附着到表面，100％的细胞悬浮在液体培养基中)。
在本发明一个实施方案中，适应的A549细胞系具有鉴定为美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号PTA-5708的细胞系的特征，PTA-5708细胞系也称作A549S细胞系。A549S细胞系的细胞在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中稳定至少137代或者6个月(即，细胞在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中表现出持续生长和稳定的病毒生产率)。A549S细胞系的细胞在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中的倍增时间为约24到88小时。在A549S细胞系无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中，总A549S细胞群体是悬浮的。在一个实施方案中，99％以上的A549S细胞是悬浮的(例如，100％的细胞是悬浮的，100％的细胞不附着到表面，100％的细胞悬浮在液体培养基中)。
在本发明的一个实施方案中，适应的A549细胞系是鉴定为美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号PTA-5708的细胞系，其也称作A549S细胞系。
“A549”是本领域公知的肺癌细胞系。在一个实施方案中，用于适应方法的A549亲代细胞系是ATCC株系CCL-185。
本文所用的术语“汇合的”指细胞已经在生长表面形成了粘附层，在粘附层上所有细胞都与其他细胞接触，从而使用了实际上所有可利用的表面。例如，已经将“汇合的”定义(R.I.Freshney，Cultureof Animal Cells-A Manual of Basic Techniques，Second Edition，Wiley-Liss，Inc.New York，N.Y.，1987，p.363)为这样的情况，其中“所有细胞都在所有它们的外周与其他细胞接触并且没有可以利用的基质没有被覆盖”。对于本发明的目的，术语“基本上汇合的”表示细胞通常在表面上接触，尽管可以剩余间隙，从而70％以上，优选90％以上的可利用的表面被使用。这里，“可利用的表面”指容纳细胞的足够表面区域。从而，相邻细胞之间不能容纳额外细胞的小间隙不构成“可利用的表面”。
可以通过使细胞逐渐从血清断奶或者通过直接适应来使哺乳动物细胞从在血清条件中生长适应到无血清的条件。逐渐断奶方法对于培养的胁迫较低并且可以导致较小的生长滞后。直接适应方法更快，但是相对苛刻并且最初的细胞密度和生活力通常下降。
许多细胞系可以从含有血清的培养基直接传代培养到无血清的培养基中。例如，当血清存在下生长的培养物为具有至少90％生活力的处于对数生长期中期的培养物时，可以将它以1∶2或1∶3的比率稀释到无血清的培养基中。每周重复该过程两次直到得到连贯生长。由于当直接从补加血清的培养基接种到无血清的培养基时细胞大量丧失，所以，起初，通常以比正常用于传代培养更高的接种密度接种培养物。在细胞生长速率返回到对补加血清的培养基中的细胞观察到的速率之前，无血清培养基中前几次传代的细胞生长速率通常较低。如果该方法不成功，那么应该使用连续的或者断奶方法。
使细胞从含有血清和血清蛋白质的培养基“断奶”或者“连续适应”到无血清和动物材料的培养基指逐渐、逐步减小培养基的血清浓度。可以通过本领域公知的方法进行逐渐减小。例如，在含有高浓度血清的第一培养基中的细胞可以用于接种含有稍少血清的第二培养基。一旦第二培养基中的细胞生长到给定细胞密度，就可以将它们又用于接种含有更少血清的第三培养基。可以重复该方法直到细胞在含有所希望量的血清的培养基中生长。
在断奶细胞的另一实例中，细胞生长在补加10％血清的基础培养基中直到细胞达到线性对数生长期的峰。然后，将细胞在补加5％血清的无血清培养基基质中传代培养。达到饱和密度后，将细胞在补加1％血清的无血清培养基基质中传代培养。随后，在每次传代培养，将血清减少50％直到血清浓度低于0.06％。然后，在无血清的培养基中保持和培养细胞。如果在适应期间任何点细胞生长下降，就将血清浓度恢复到促进细胞生长的点。在进行血清减少方案前允许细胞生长到在那一血清浓度稳定。一旦细胞适应了无血清的条件，则继续进行培养基蛋白质减少方案，如在每次传代培养时，加入等同体积的无血清并且无动物材料的培养基直到培养物在无血清并且无动物材料的培养基条件下繁殖。在该方法的变通方案中，可以将细胞直接适应到无血清并且无动物材料的培养基条件，其中不使用中间的无血清培养基步骤。
断奶细胞的另一个实例是在含有血清的培养基，如含有5-10％血清的基础培养基中繁殖细胞到90％饱和密度。使用50％的含有血清的培养基和50％的不含血清的培养基以1∶1比率进行传代培养。第二天，以相同方式传代培养细胞。在某点，细胞倍增将减小并且细胞培养之间的时间间隔将增加。根据需要，继续1∶1传代培养细胞，直到每天传代培养细胞。一旦细胞适应了无血清的条件，就继续培养基血清蛋白质减少方案，如在每次使用50％无血清培养基和50％无血清并且无动物材料的培养基的1∶1传代培养中，直到每天传代培养细胞。在该点，可以将细胞调节到分离比(split ratio)大于1∶1的传代培养程序。在该方法的变通方案中，可以将细胞直接适应到无血清并且无动物材料的培养基条件，其中不使用中间的无血清培养基步骤。
在断奶细胞的另一实例中，在每次传代时，将培养物稀释到含有血清的培养基和无血清的培养基的混合物中。最初可以使用含有血清的培养基和无血清的培养基的1∶1比率。对于每次随后的传代，增加无血清的培养基的相对量直到实现完全独立于血清。在每次传代时，培养物应在对数生长期中期并且向培养基的稀释应该大约在1∶2到1∶3的比率。细胞应该每周传代培养两次。在每次传代时，如果新培养基条件不成功，则应该用已知足够保持细胞生活力的血清浓度接种备份瓶。
对于在血清存在下贴壁的细胞系，如A549，对无血清的培养基或者无血清并且无动物材料的培养基的适应将常常导致培养物变得松弛地贴壁，可能形成团，和具有大的细胞团块。
可以通过本领域公知的方法将细胞引入悬浮培养。例如，可以使用细胞刮棒将贴壁培养的细胞从它们的生长表面取下并再置于容器，如摇瓶或者旋转瓶中，在瓶中持续搅动培养物。在另一实例中，可以通过胰蛋白酶消化从生长表面取下培养物的细胞，然后灭活胰蛋白酶，或者通过洗涤细胞除去胰蛋白酶，然后将细胞置于容器中的悬浮培养中。备选地，贴壁培养的细胞可以通过非酶方法，如通过轻微拍打培养容器或者通过用含有二价离子螯合剂的溶液处理从基质取出。例如，可以使用二价离子螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-二((3-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)。可以振荡、摇动、搅动或者搅拌悬浮培养物以保持细胞悬浮。
许多细胞类型倾向于在悬浮培养中以细胞团生长，特别是最初来自附着或者贴壁细胞系的培养物。具有可变水平细胞聚集的培养物可以显示出不同的生长动力学。团块大小的控制是重要的问题。在团块内可能发生细胞死亡和坏死。严重的聚集由于空间和代谢扩散的限制可以导致很差的细胞生长。此外，如果细胞是用于病毒生产方法的宿主细胞，那么极度的细胞聚集可以通过防止团块的内部细胞感染并从而减小所得的总体病毒效价而不利地影响感染效率。生物量测量和聚集定量在确定聚集的悬浮培养中细胞生长和行为中都是重要的。评估悬浮培养中的细胞聚集的程度对于监控悬浮过程是重要的。
可以通过本领域已知的任意方法确定培养中细胞团块或团的存在。例如，可以通过显微镜或者使用细胞筛分装置，如COULTERCOUNTER(Beckman Coulter，Inc.，Particle Characterization，1950West 8th Avenue，Hialeah，FL，33010，美国)或者AccuSizer 780/SPOSSingle Particle Optical Sizer(Particle Sizing Systems，668Woodbourne Road，Suite 104，Langhorne，PA，19047，美国)观察团块的存在。定量细胞聚集的其他自动化方法是本领域公知的(Neelamegham等人，Ann.Biomed.Eng.25(1)180-9(1997)；Tsao等人，Biotechnol.Prog.16809-814(2000))。在本发明的一个实施方案中，Tsao等人(Biotech.Prog.16809-814(2000))的方法可以用于定量地监控细胞聚集和细胞生物量。
适应的A549细胞是在无血清和悬浮培养中生长的悬浮感受态细胞，其为单个悬浮细胞与小团块的混合物，即单分散的细胞和直径400微米到直径20微米的团块中的细胞。已经通过将贴壁-依赖性的细胞逐渐适应到那些条件使得适应的A549细胞对在无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中的生长是感受态的。通过向培养物中加入液体混合物也可以减小形成细胞团的量。加入化学成分确定的液体混合物可以避免向培养物中引入动物产物。
在A549细胞的悬浮适应过程中，可以选择性保留不与大的细胞团结合的细胞。可以通过本领域公知的方法进行不与大的细胞团结合的细胞的选择性保留。例如，停止搅动悬浮培养物1到2分钟，从而允许细胞团块沉降到培养容器的底部。取出含有单个细胞和小团块中的细胞的培养物的90％体积并在新的容器中传代培养。丢弃最初培养物的10％体积的含有大细胞团块的剩余培养物体积。在另一实例中，停止搅动悬浮培养物1到2分钟，从而允许细胞团块沉降到培养容器的底部。用移液器从容器的底部取出含有大细胞团块的10％体积的培养物并丢弃。将占90％最初培养物体积的含有单个细胞和小细胞团块的剩余培养物体积进行传代培养。250ml、500ml和1L大小的摇瓶的培养容器优选分别有30到40ml、100ml和240ml的培养体积。
以这种方式，从培养物，即细胞群体除去由几百个细胞或更多细胞组成的团块。可以通过多轮选择，例如，通过重复该方法富集所希望的细胞群体。所得细胞将比相同悬浮培养基中非适应的细胞显示出较少的团形成或者较低程度的细胞聚集。
培养期间培养物形成团或聚集的程度可以通过颗粒，即细胞团块，大小测量，其中使用AccuSizer 780/SPOS单颗粒光学筛分器(Single Particle Optical Sizer)来监控。在该仪器中，单个颗粒被激光束穿过并测量每个颗粒阻断的光的量。被阻断的光的量对应于颗粒的横截面面积并从而对应于细胞团或细胞团块大小。以表格形式或者柱状图报告单个细胞和细胞团的分布图。该光学筛分器能够检测直径为例如10到15微米的单个细胞到直径最高达400微米的细胞团块的颗粒大小。例如，该仪器使用的优选的探针检测大小为直径0.5微米到400微米的颗粒。
在一个实施方案中，通过Tsao等人(Biotechnol.Prog.16809-814(2000))中公开的方法进行细胞聚集或者细胞聚集程度的监控。
适应的A549细胞系的细胞可以作为单个细胞与小细胞团块的混合物存在于无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中。这部分通过选择性消除大细胞团或大细胞团块实现。认为在适应过程中已经除去形成更大团块的细胞群体。所除去的细胞团块或细胞团可以直径大于400微米。剩余并且培养的细胞团块优选为小的团块，其大小为100微米到20微米。单个细胞大小为直径10到15微米的范围。
在无血清且无动物材料的悬浮培养中培养稳定的适应的A549(也称作A549S)中存在的细胞团块或细胞团可以直径小于400微米，例如，350微米，通常小于至少300微米，例如，250微米，小于至少200微米，例如，150微米，小于至少100微米，例如，90、80、70、60微米，小于至少50微米，例如，40、30微米，和直径小于至少25微米。单个细胞的直径范围为10到15微米。
颗粒大小的分布和累积细胞体积同时提供了关于培养物的聚集状态的信息。通过下面的方法描述使用AccuSizer 780/SPOS单颗粒光学筛分器对聚集状态的定量。一种方法是柱状图，其概述所有颗粒，即细胞和细胞团块的累积体积的分布。形成细胞团的程度可以通过累积聚集图，例如，累积细胞体积分布图代表。聚集的程度还可以以数字方式表示。选择累积曲线穿过柱状图或图表上25％、50％和75％标记时的百分数点。结果的数字表示，如50％标记，提供了样品之间聚集程度的方便且一致的比较。
所适应的A549细胞系根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)在2003年12月23日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Blvd.，Manassas，VA，20110-2209，美国)，保藏名和编号如下保藏名“A549S”；ATCC编号PTA-5708。当专利授权后对使用保藏在ATCC的细胞系的所有限制都将取消。
“悬浮培养”指细胞培养，其中培养容器中的主要或者所有细胞都悬浮存在，例如，不附着到任何基质或者表面、容器表面或者容器内的另一表面。可以振荡、摇动、搅动、转动或者搅拌悬浮培养物以保持细胞悬浮。
“含有血清的培养基”包括含有来自任何生物的血清的任何生长培养基。例如，含有血清的培养基包括含有胎牛血清、新生牛血清、牛血清、人血清、马血清、鸡血清、山羊血清、猪血清、兔血清和/或绵羊血清的培养基。血清可以经热失活、透析、γ-辐射、去脂或者去纤维蛋白。血清还可以补加例如铁或者生长因子。
“无血清的培养基”包括缺少血清的任意培养基。在本领域中，无血清的培养基可以描述不需要补加血清来支持细胞生长的一类培养基。无血清的培养基可以含有不连续的蛋白质或者大批蛋白质级分。蛋白质可以是动物来源的。优选的通过商业途径可获得的无血清的培养基制剂的实例是来自JRH Biosciences，Inc.，13804W.107thStreet，Lenexa，Kansas，66215，美国的EX-CELLTM520和EX-CELLTM301。
“无血清且无动物材料的”培养基指不含有动物来源的组分的培养基。在本领域中，细胞培养基生产商对无血清的和无血清且无动物材料的培养基的定义可以不同。无血清的或无血清且无动物材料的培养基也可以描述为无血清的、化学成分确定的培养基。这些培养基是不含有未知组成的组分的无血清培养基的亚类。这些培养基没有动物来源的组分并且所有组分都有已知的化学结构。无蛋白质的培养基是无血清培养基的亚类，它们没有所有蛋白质，但是可以含有植物或者酵母水解产物。
“无血清且无动物材料的培养基悬浮培养物”或者“无血清且无动物材料的悬浮培养物”指在无血清且无动物材料的培养基中繁殖的悬浮培养物。无血清且无动物材料的培养基悬浮培养物包含细胞和培养基。培养物含有由在培养基中生长或培养的细胞分泌、衍生或者生产的蛋白质。如果病毒繁殖，那么培养物包含细胞、病毒和培养基。生产病毒的培养物含有来自细胞和病毒的蛋白质。
通过商业途径可获得的无动物材料的合成细胞培养基可以用作无血清且无动物材料的培养基。优选的无血清且无动物材料的培养基的实例包括来自Irvine Scientific，2511 Daimler Street，Santa Ana，CA，92705，美国的IS 293-VTM。
可以筛选通过商业途径可获得的无血清的培养基作为无血清培养基的适宜性。例如，可以筛选通过商业途径可获得的培养基支持A549细胞在摇瓶中生长的能力。例如，可以使用目的培养基将来自贴壁培养的细胞转移成悬浮的。在另一实例中，来自已经建立的悬浮培养的细胞可以从它们的当前培养基转换到目的培养基中。通过血细胞计数器计数监控细胞生长。通过显微镜检查评估形成细胞团的程度。例如，来自该筛选方法的结果发现来自JRH Biosciences，Inc.，(13804W.107thStreet，Lenexa，Kansas，66215，美国)的培养基EX-CELLTM520和EX-CELLTM301支持A549细胞生长而无大的团块。这些培养基可以作为无血清的培养基进一步开发。来自筛选方法的额外结果发现例如，在Condon等人，(Biotechnol.Prog.19137-143(2003))中公开的用于悬浮培养HEK293细胞的补加0.1％PLURONIC F-68(GIBCO)、10mM Tris*HCl(pH 7.4，Biowhittaker)、1X痕量元素(Trace Elements)A、B和C(Mediatech)和13.4mg/L葡糖酸亚铁(Fluka))的无血清且无动物材料的培养基，例如，IS 293-V(Irvine Scientific)支持A549细胞生长而无大的团块。可以将该培养基进一步开发为无血清且无动物材料的培养基。
同样，例如，下面的通过商业途径可获得的培养基在筛选方法中不支持A549细胞生长CD 293(GIBCO，Invitrogen)；AIM-V(GIBCO，Invitrogen，Inc.，)；RPMI 1640(GIBCO，Invitrogen，Inc.，)；293SFM II(GIBCO，Invitrogen，Inc.，)；用于腺病毒生产的基因治疗培养基3(Gene Therapy Medium 3for AdenovirusProduction)(Sigma-Aldrich，P.O.Box 14508，St.Louis，MO，63178，美国)；和用于悬浮培养的无CHO蛋白培养基，无动物组分培养基(CHO Protein-free Medium，Animal Component-free Medium forSuspension Culture)(PF-ACF-CHO)(Sigma-Aldrich)。不进一步开发这些培养基。此外，例如，培养的A549细胞在下面通过商业途径可获得的培养基中形成大的团块ULTRACHOTM(Biowhittaker，Cambrex Corp.，One Meadowland Plaza，EastRutherford，NJ，07073，美国)；ULTRACULTURETMCulture(Biowhittaker，Cambrex Corp.)；和IS-CHO-VTM(IrvineScientific)。不进一步开发这些培养基。
无血清且无动物材料的培养基补加铁补充物，该铁补充物经设计用来替换用于铁转运的转铁蛋白。通过商业途径可获得的铁补充物的实例是来自Sigma-Aldrich，P.O.Box 14508，St.Louis，MO，63178，美国的化学成分确定的铁补充物(Chemically-Defined IronSupplement)，产品号为I3153，它含有222-334ppm铁和铁结合的合成的转运分子。该复合物被转运到细胞中，在细胞中铁被释放并可以为细胞利用。Sigma-Aldrich的化学成分确定的铁补充物以1ml/l培养基的稀度使用。通过商业途径可获得的铁补充物的优选实例是Irvine Scientific(Irvine Scientific，2511 Daimler Street，Santa Ana，CA，92705，美国)的铁螯合物(Iron Chelate)，产品号为9343，它以1ml到3ml/l培养基，优选3ml/l培养基的稀度使用。通过商业途径可获得的铁补充物的另一优选实例是葡糖酸亚铁，其以13mg/l培养基的浓度使用。
培养基补充脂类或者脂类前体，如胆碱、油酸、亚油酸、乙醇胺或者磷酸乙醇胺以促进细胞的生长。有通过商业途径可获得的浓缩的脂类混合物用于补充培养基。通过商业途径可获得的脂类混合物浓缩物的一个实例是Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich，P.O.Box 14508，St.Louis，MO，63178，美国)的脂类培养基补充物(Lipid MediumSupplement)(100X)，产品号为L2273，以10ml/l培养基的稀度使用。Sigma-Aldrich的脂类培养基补充物(100X)的配方如下100ml/L Sigma-Aldrich的脂类混合物(Lipid Mixture)，产品号为L5146，和100g/L PLURONIC F-28，产品号为P 1300。用于制备脂类培养基补充物(100X)的Sigma-Aldrich的脂类混合物，产品号为L5146的配方如下胆固醇(4.5g/L)；鳕鱼肝油脂肪酸甲酯(10g/L)；聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(25g/L)；和D-α-生育酚乙酸酯(2g/L)。通过商业途径可获得的脂类混合物浓缩物的优选实例是GIBCO，Invitrogen Corporation(Invitrogen Corporation，1600Faraday Avenue，Carlsbad，California，92008，美国)的化学成分确定的脂类浓缩物，产品号为11905-031，以1ml到10ml/升培养基，例如，0.1％v/v到1％v/v，优选1ml/l培养基，例如，0.1％v/v，更优选4ml/升培养基，例如，0.4％v/v，甚至更优选10ml/升培养基，例如，1％v/v的稀度使用。GIBCO，Invitrogen Corporation的化学成分确定的脂类浓缩物，产品号为11905-031的配方如下PLURONIC F-68(100,000mg/L)；乙醇(100,000mg/L)；胆固醇(220mg/L)；Tween 80(也称作聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)(2,200mg/L)；DL-α-生育酚乙酸酯(70mg/L)；硬脂酸(10mg/L)；肉豆蔻酸(10mg/L)；油酸(10mg/L)；亚油酸(10mg/L)；棕榈酸(10mg/L)；棕榈油酸(10mg/L)；花生四烯酸(2mg/L)；和亚麻酸(10mg/L)。
无血清并且无动物材料的培养基补加非离子表面活性剂，例如，PLURONIC F68。PLURONICS是一系列非离子表面活性剂，它们具有一般结构HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2OH)b(CH2CH2O)cH，其中b为至少15并且(CH2CH2O)a+c按重量计为20％到90％。也已知PLURONICS是例如泊洛沙姆；甲基环氧乙烷聚合物，与环氧乙烷的聚合物；和聚乙二醇-聚丙二醇，聚合物。特别优选的非离子表面活性剂是PLURONIC F68。培养基中所用的非离子表面活性剂，例如，PLURONIC F68的量可以为0.05％到0.4％，特别优选为0.1％到0.05％，更尤其优选0.1％。该试剂通常用于保护细胞免于搅动和通气的不利影响(Murhammer和Goochee，1990，Biotechnol.Prog.6142-148；Papoutsakis，1991，Trends Biotechnol.9316-324)。
此外，对培养基补充无机痕量元素以增强细胞的生长，如硒、谷氨酰胺、硫酸铜、柠檬酸铁、亚硒酸钠、硫酸锌、钼酸铵、钒酸铵、硫酸锰、硫酸镍、硅酸钠、氯化亚锡、氯化铝、乙酸钡、氯化镉、氯化铬、二氯化钴、二氧化锗、溴化钾、硝酸银、氟化钠和二氯氧化锆。
存在可以通过商业途径获得的痕量元素的浓缩混合物，例如Mediatech的痕量元素A1,000X溶液，产品号为99-182-CI；Mediatech的痕量元素B1,000X溶液，产品号为99-175-CI；和Mediatech的痕量元素C1,000X溶液，产品号为99-176-CI(Mediatech，Inc.，13884 Park Center Road，Herndon，VA，20171，美国)。Mediatech的痕量元素A、痕量元素B和痕量元素C溶液的每一种都以1ml/l培养基的稀度使用。Mediatech的痕量元素A1,000X溶液，产品号为99-182-CI的配方如下CuSO4*5H2O(1.6mg/L)；ZnSO4*7H2O(863mg/L)；亚硒酸钠(17.3mg/L)；和柠檬酸铁(1155.1mg/L)。Mediatech的痕量元素B1,000X溶液，产品号为99-175-CI的配方如下MnSO4*H2O(0.17mg/L)；Na2SiO3*9H2O(140mg/L)；钼酸，铵盐(1.24mg/L)；NH4VO3(0.65mg/L)；NiSO4*6H2O(0.13mg/L)；和SnCl2(无水的)(0.12mg/L)。Mediatech的痕量元素C1,000X溶液，产品号为99-176-CI的配方如下AlCl3*6H2O(1.2mg/L)；AgNO3(0.17mg/L)；Ba(C2H3O2)2(2.55mg/L)；KBr(0.12mg/L)；CdCl2(2.28mg/L)；CoCl2*6H2O(2.38mg/L)；CrCl3(无水的)(0.32mg/L)；NaF(4.2mg/L)；GeO2(0.53mg/L)；KI(0.17mg/L)；RbCl(1.21mg/L)；和ZrOCl2*8H2O(3.22mg/L)。
此外，对无血清并且无动物材料的培养基补加缓冲剂以帮助控制细胞培养的pH水平。例如，缓冲剂包括碳酸氢钠、一元和二元磷酸盐、HEPES((N-2-羟乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸)；4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)；和其盐))，和Tris((三(羟甲基)氨基甲烷；三(2-氨基乙基)胺；和其盐))。
此外，对无血清并且无动物材料的培养基补加氨基酸L-谷氨酰胺，其在培养基中的浓度为2mM到20mM，优选至少2mM，例如，1mM或3mM，更优选至少4mM，例如，5mM、6mM或7mM，更优选至少8mM，例如，9mM或者10mM。
任选地，对无血清并且无动物材料的培养基补加糖，如D-葡萄糖，糖的浓度为0.1-10g/l培养基，至少2g/l培养基。
在一个实施方案中，无血清并且无动物材料的培养基是IrvineScientific的IS 293-VTM(Irvine Scientific，2511 Daimler Street，SantaAna，CA，92705，美国)，其补加0.1％PLURONIC F68(InvitrogenCorporation，1600 Faraday Avenue，Carlsbad，California，92008，美国)，Irvine Scientific的铁螯合物(3ml/l培养基)、15mM TRIS缓冲液、Mediatech(Mediatech，Inc.，13884 Park Center Road，Herndon，VA，20171，美国)的痕量元素A(1ml/l培养基)、Mediatech的痕量元素B(1ml/l培养基)和Mediatech的痕量元素C(1ml/l培养基)、8mM L-谷氨酰胺和GIBCO，Invitrogen的化学成分确定的脂类浓缩物(1％v/v)(Invitrogen Corporation)。
在另一实施方案中，无血清并且无动物材料的培养基是IrvineScientific的IS 293-VTM(Irvine Scientific，Santa Ana，California，美国)，其补加0.1％PLURONIC F68(Invitrogen Corporation)、葡糖酸亚铁(13mg/l培养基)、15mM TRIS缓冲液、Mediatech的痕量元素A(1ml/l培养基)、Mediatech的痕量元素B(1ml/l培养基)和Mediatech的痕量元素C(1ml/l培养基)、8mM L-谷氨酰胺和GIBCO，Invitrogen的化学成分确定的脂类浓缩物(1％v/v)(Invitrogen Corporation)。
细胞培养和病毒生产可以通过将细胞培养在适宜的培养基，如无血清并且无动物材料的培养基，优选以悬浮培养简单地增殖本发明的适应的A549细胞系。
一旦细胞已经适应，就可以将它们冷藏并保存备用。优选地，通过如下步骤冷藏细胞，将适应的A549细胞增殖到晚期指数生长期；浓缩细胞；将生长培养基交换为例如补加冷冻保护剂和稳定剂的无血清且无动物材料的培养基或者含血清的培养基的培养基；冷冻细胞；并在0℃或更低温度下保存细胞。
优选地，细胞保存在-70℃或以下，例如，-80℃，或者在液氮中或者在液氮的蒸汽相中。
可以通过本领域公知的任意方法浓缩细胞。例如，可以通过离心、沉降、用灌注装置(例如，筛网)浓缩或通过过滤浓缩。优选地，将细胞浓缩到至少1×107个细胞/ml。
细胞可以保存在本领域已知的任意冷冻保护剂中。例如，冷冻保护剂可以是二甲基亚砜(DMSO)或者甘油。细胞可以保存在本领域已知的任意稳定剂中。例如，稳定剂可以是甲基纤维素或者血清。
冷冻前，可以将浓缩的细胞分配于几个单独的容器中以产生细胞库。细胞可以保存在例如玻璃或者塑料瓶或者管或者细胞培养袋中。当需要细胞备用时，可以从细胞库选择一部分冷藏的细胞(从一个容器)，解冻并且不进行适应而用于无血清并且无动物材料培养基悬浮培养中。
可以通过本领域已知的用于哺乳动物细胞悬浮培养的任意方法增殖或生长适应的A549细胞。适应的A549细胞可以不进一步适应就生长在无血清并且无动物材料的悬浮培养中。可以通过一步或多步方法进行增殖。在一步增殖方法中，从贮藏中取出适应的A549细胞并直接接种到培养容器中，在该培养容器中发生病毒的生产。在多步增殖方法中，从贮藏中取出适应的A549细胞并通过许多培养容器进行增殖，所述容器逐渐增加大小直到得到最终培养容器，在该培养容器中进行病毒的生产。在增殖步骤期间，细胞在最优化生长的条件下生长。培养条件，如温度、pH、溶解氧水平等等是已知对特定细胞系最优化的条件并且将是本领域技术人员显而易见的(见，例如，Animal Cell cultureA Practical Approach第二版，Rickwood，D.和Hames，B.D.eds.，Oxford University Press，New York(1992))。
当增殖适应的A549细胞，或者在细胞中生产病毒，例如腺病毒的适应的A549细胞时，来自最初瓶的细胞可以在无血清或者无血清并且无动物材料的培养基中生长到生物量。具有高细胞密度的生物量可以在病毒增殖和生产过程中保持在无血清或者无血清并且无动物材料的培养基中。
可以在本领域已知的任意适宜的容器中生长适应的A549细胞和培养生产病毒的适应的A549细胞。例如，细胞可以生长在并且受感染的细胞可以培养在生物产生器(biogenerator)或生物反应器中。通常“生物产生器”或“生物反应器”指培养罐，其通常由不锈钢或玻璃制造，体积为0.5升或更大，包含搅动系统，用于注射CO2气体流的装置和充氧装置。通常，它装备用于测量生物产生器的内部参数的探针，所述内部参数为诸如pH、溶解氧、温度、罐压力或者培养的某些理化参数(例如，葡萄糖或者谷氨酰胺的消耗或者乳酸和铵离子的产生)。将pH、氧和温度探针连接到生物处理器，其永久调节这些参数。在其他实施方案中，容器是旋转瓶、滚动瓶、摇瓶或者具有提供机械搅动的搅拌棒的瓶。在另一实施方案中，容器是WAVE生物反应器(WAVE Biotech，Bridgewater，NJ，美国)。可以振荡、摇动、搅动、滚动或者搅拌悬浮培养物以保持细胞悬浮。
可以通过本领域已知的任意方法测定适应的A549培养物的细胞密度。例如，可以通过显微镜术，例如用血细胞计数器，或者通过电子细胞计数装置(例如，COULTER COUNTER；AccuSizer 780/SPOS单颗粒光学筛分器)测定细胞密度。
术语“世代数”指细胞培养物已经经历的群体倍增的数目。群体倍增的计算是本领域公知的(见，例如，Patterson，Methods inEnzymology，编著，Jakoby and Pastan，Academic，New York，58150-151(1979))。在一个实施方案中，按照公式ln(细胞质量增加倍数)/ln2通过计算培养期间细胞分裂次数，来确定培养物的体外细胞年龄或世代数。在一个实施方案中，通过Tsao等人(Biotechnol.Prog.16809-814(2000))中公开的方法测量细胞质量的增加。
术语“重组体”指通过常规重组DNA技术修饰的基因组。
本文所用的术语“病毒”不仅包括天然存在的病毒，而且包括重组病毒、减毒病毒、疫苗株系等等。重组病毒包括，但不限于，包含异源基因的病毒载体。术语重组病毒包括嵌合(或者甚至多聚体的)病毒，即使用来自一种以上病毒亚型的互补编码序列构建的载体。见，例如，Feng等人Nature Biotechnology 15866-870(1997)。在一些实施方案中，由宿主细胞、辅助病毒或者辅助质粒提供病毒复制的辅助功能。代表性载体包括，但不限于，将感染哺乳动物细胞，特别是人细胞，并且可以来自诸如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和禽痘病毒的那些载体。
任何病毒都可以在本发明的细胞培养物中增殖。在一个实施方案中，病毒是腺病毒。术语“腺病毒”与术语“腺病毒载体”同义，并且指腺病毒科属的病毒。术语腺病毒科共同指哺乳动物腺病毒属的动物腺病毒，包括但不限于人、牛、羊、马、狗、猪、鼠和猿腺病毒亚属的动物腺病毒。具体地，人腺病毒包括A-F亚属以及其个体血清型。例如，可以在本发明的细胞培养物中生产任意腺病毒类型1、2、3、4、4a、5、6、7、7a、7d、8、9、10、11(Ad11A和Ad11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91。在本发明的优选实践中，腺病毒为或者来自人腺病毒血清型2或5。
在本发明的一个实施方案中，腺病毒包含野生型、未突变的基因组。在另一实施方案中，病毒包含突变的基因组；例如，突变的基因组可以缺少片段或者可以包括一个或多个额外的异源基因。在另一实施方案中，病毒是选择性复制的重组病毒或者条件复制病毒，即在正常细胞中减毒但是在肿瘤细胞中保持病毒复制的病毒。见，例如，Kirn，D.等人，Nat.Med.7781-787(2001)；Alemany，R.等人NatureBiotechnology 18723-727(2000)；Ramachandra，M.等人，ReplicatingAdenoviral Vectors for Cancer Therapy in Pharmaceutical DeliverySystems，Marcel Dekker Inc New York，pp.321-343(2003)。
在本发明的一个实施方案中，选择性复制的重组病毒是选择性复制的重组腺病毒或者腺病毒载体，如公开的国际申请号WO 00/22136和WO 00/22137；Ramachandra，M.等人，Nature Biotechnol.191035-1041(2001)；Howe等人，Mol.Ther.2(5)485-95(2000)；和Demers，G.等人Cancer Research 634003-4008(2003)中所速的那些腺病毒或腺病毒载体。
选择性复制的重组腺病毒也可以描述为，但不限于“溶瘤腺病毒”、“溶瘤复制性腺病毒”、“复制性腺病毒载体”、“条件复制腺病毒载体”或者“CRAV”。
在本发明的另一实施方案中，腺病毒是01/PEME，也称作cK9TB或K9TB，其通过在E1a基因和E3区中缺失、插入驱动E2F拮抗剂E2F-Rb的p53应答启动子和插入主要晚期启动子调节的E3-11.6K基因而修饰为在正常细胞中减弱复制，并且描述于例如Ramachandra，M.等人，Nature Biotechnol.191035-1041(2001)；美国专利申请公开号US2002/0150557；和Demers，G.等人Cancer Research634003-4008(2003)。
术语“感染”指在一定条件下将病毒暴露于适应的A549细胞以促进细胞被病毒感染。在其中已经受到多个拷贝给定病毒感染的细胞中，病毒复制和病毒体包装所需的活性是协同的。从而，优选调节所述条件，从而使得存在适应的A549细胞受到病毒多重感染的很大可能性。增强适应的A549细胞中病毒生产的条件的一个实例是与感染期中细胞浓度相比增加的病毒浓度。然而，可能每个细胞感染的总数可能太高，从而导致对细胞的毒性效应。因此，优选保持病毒颗粒与A549细胞的比率在感染时为(40到60)∶1。
术语“在一定条件下培养以允许病毒基因组复制”指对受感染的A549细胞保持所述条件以便允许病毒增殖。含有病毒的细胞包括受到病毒感染的细胞和正生产病毒的细胞。希望控制培养条件从而使每个细胞生产的病毒颗粒数最大化。希望监控和控制培养条件，如温度、溶解氧、pH、搅动和本领域技术人员已知的其他条件。通过商业途径可获得的生物反应器，如BIOSTAT系列的生物反应器(B.Braun Biotech，Inc.，Allentown，PA，美国)有监控和保持此类参数的设备。然而，感染和培养条件的最优化将有点可变，可以由本领域技术人员通过考虑例如细胞系的已知性质、病毒的性质和生物反应器的类型来实现病毒的有效复制和生产的条件。
病毒，如腺病毒可以在本发明的适应的A549细胞或者悬浮A549细胞中生产。可以通过如下步骤生产病毒，培养适应的A549细胞；任选向细胞加入新鲜生长培养基；用病毒接种细胞；任选用氯化钙(CaCl2)补充细胞培养物；温育接种的细胞(任意时间段)；任选向接种的细胞加入新鲜生长培养基；任选用氯化钙补充细胞培养物；和任选从细胞和培养基收获病毒。通常，当病毒颗粒的浓度开始出现平台时，如通过如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)中描述的常规方法，如高效液相层析使用Resource Q柱测定的，进行收获。
通常，受感染的、适应的A549细胞能够在培养中保持以36×109到144×109vp/ml的范围生产CRAV腺病毒至少137代或者至少6个月。
可以在病毒接种之前和/或之后对细胞提供新鲜培养基。例如，可以通过灌注加入新鲜培养基。培养基交换增加了适应的A549细胞或者适应的A549培养物中病毒生产的水平。在本发明的一个实施方案中，对受感染的适应的A549细胞的培养基进行两次连续交换，一次交换在感染后，另一次交换在感染后1天。可以对细胞提供有或者没有额外的钙的新鲜培养基。
可以在病毒接种后对适应的A549细胞提供钙。将钙以可溶形式，例如，作为氯化钙或者硫酸钙加入培养物。钙加入增加了适应的A549细胞或适应的A549培养物中病毒生产的水平。在本发明的一个实施方案中，病毒感染后向培养物加入氯化钙。在另一实施方案中，病毒接种后2小时加入氯化钙。在另一实施方案中，病毒感染后2到8小时向培养物加入氯化钙。在另一实施方案中，感染后20到24小时加入氯化钙。用于新鲜培养基或者细胞培养物中的额外的氯化钙浓度范围为0.2mM到1.6mM。在本发明的一个实施方案中，使受感染的适应的A549细胞或者受感染的适应的A549培养物进行与补加额外的1.6mM氯化钙的新鲜培养基的两次连续交换，一次交换在感染后，另一交换在感染后1天。
用于生产病毒的适应的A549细胞可以来自在无血清且无动物材料的培养基条件下冷冻的细胞系或者来自在含有血清的培养基条件下冷冻的细胞系，例如，来自冷冻的细胞库。
用于鉴定培养物中病毒的存在，即，证明培养物中存在病毒蛋白质的适宜方法包括免疫荧光检测，其可以使用针对一种病毒蛋白质的单克隆抗体或者多克隆抗体(Von Bülow等人，in Diseases ofPoultry，10th edition，Iowa State University Press)、聚合酶链反应(PCR)或嵌套式PCR(Seiné等人，Avian Diseases 37467-476(1993))、ELISA(Von Bülow等人，in Diseases of Poultry，10thedition，Iowa State University Press))、通过流式细胞术分析的六邻体表达(Musco等人Cytometry 33290-296(1998)、病毒中和或者用于鉴定特定病毒蛋白质的任意常规组织化学方法。
可以通过本领域已知的技术，如Villegas等人，“Titration ofBiological Suspensions，”InA Laboratory Manual for the Isolationand Identification of Avian Pathogens，3rd Ed.，Purchase等人，Eds.，Kendall/Hunt Publishing Co.，Dubuque，Iowa(1989)中描述的方法进行培养物中病毒的量的滴定。在特定实施方案中，如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)描述的，通过ResourceQ测定法测定病毒颗粒的浓度。本文所用的术语“裂解”指破裂含有病毒的细胞。可以通过本领域公知的多种方法实现裂解。例如，可以在低压(100-200psi差压)条件下、通过匀浆、通过微流化(microfluidization)或者通过常规的冻融方法裂解哺乳动物细胞。
可以冷冻含有病毒的细胞。可以从含有病毒的细胞和培养基收获病毒。在一个实施方案中，同时从含有病毒的细胞和培养基收获病毒。在特定实施方案中，将生产病毒的细胞和培养基在同时裂解含有病毒的细胞和澄清将干扰病毒纯化的细胞碎片的培养基的条件下，如美国专利号6,146,891描述的，进行交叉流微量过滤。
可以分别从含有病毒的细胞和培养基收获病毒。可以通过常规方法，如差速离心单独从培养基回收含有病毒的细胞。收获的细胞可以冷冻保存或进一步通过裂解处理以释放病毒。可以通过层析方法从培养基收获病毒。可以用DNA酶/RNA酶，如BENZONASE(AmericanInternational Chemicals，Inc.)降解除去无Exogenase的DNA/RNA。
可以通过诸如美国专利号6,146,891和6,544,769中描述的超滤或者切向流过滤的方法进一步处理病毒收获物以浓缩病毒。
可以通过本领域公知的任意方法分离和纯化本发明的细胞培养物中生产的病毒颗粒。例如，可以通过氯化铯梯度纯化、柱层析或分批层析、二乙氨乙基(DEAE)层析(Haruna等人Virology 13264-267(1961)；Klemperer等人，Virology 9536-545(1959)；PhilipsonVirology 10459-465(1960))、羟基磷灰石层析(美国专利申请公开号US2002/0064860)和使用其他树脂的层析法纯化病毒颗粒，所述其他树脂为诸如均匀交联的多糖，其包括软凝胶(例如，琼脂糖)，基于合成聚合物的大孔聚合物，其包括具有大“直通孔(throughpore)”的灌注层析树脂，“触手”吸着剂，其具有设计用于与蛋白质更快相互作用的触手(例如，fractogel)，和基于刚性壳中软凝胶的材料，其利用软凝胶的高容量和复合材料的刚性(例如，Ceramic HyperDF)(Boschetti，Chromatogr.658207(1994)；Rodriguez，J.Chromatogr.69947-61(1997))。在特定实施方案中，通过柱层析，如Huyghe等人Human Gene Therapy 61403-1416(1995)；美国专利号5,837,520；和美国专利号6,261,823中描述的纯化病毒。
蛋白质纯化也可以分离和纯化在本发明的适应的A549细胞中生长的腺病毒(优选包含编码目的多肽的异源基因的腺病毒)生产的蛋白质。
可以通过标准方法纯化本发明的蛋白质、多肽和抗原片段，所述方法包括但不限于盐或者醇沉淀、亲和、制备型圆盘凝胶电泳、等电聚焦、高压液相层析(HPLC)、反相HPLC、凝胶过滤、阳离子和阴离子交换和分配层析和反流分布法。此类纯化方法是本领域公知的并且公开在例如“Guide to Protein Purification”，Methods inEnzymology，Vol.182，M.Deutscher，Ed.，1990，Academic Press，New York，NY。
实施例提供下面的实施例以更清楚地描述本发明，并且不应将这些实施例理解为以任何方式限制本发明的范围。
表1列出了用于实施例中的多种培养基。
表1培养基
实施例1贴壁A549细胞向无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养的适应按照通过胰蛋白酶消化培养贴壁细胞的标准方案，将A549细胞解冻并在T-75培养瓶中的培养基1(表1)中传代。适应过程花费3-6周来完成。为启动悬浮适应过程，通过将细胞通过含有逐步降低水平血清的培养基连续传代使贴壁细胞逐渐断奶。这通过在每次细胞培养传代时用增加体积的无血清并且无动物材料的悬浮培养基培养基2(见表1)稀释培养基1(见表1)来进行。结果，血清水平逐步降低，在每次传代时从最初的10％胎牛血清(FBS)水平降低50％，直到最终FBS浓度低于0.3％。每次传代花3到5天。传代细胞直到一些细胞变得不贴壁(例如，不附着到培养容器的表面)。
在含有0.3％FBS的培养基中传代一次后，从T75瓶胰蛋白酶消化细胞，将其再接种到250ml摇瓶(40ml培养体积)中含有相同的0.3％FBS的培养基中，并在37℃在振荡培养箱中生长，培养箱中具有5％CO2的气氛并且以85rpm进行振荡。
转移到悬浮培养后，用无血清并且无动物材料的培养基培养基2(见表1)进行所有随后的传代培养，以完成从血清的断奶。允许细胞生长到约2×106到2.5×106个细胞/ml。然后将培养物用培养基2(见表1)以1∶2分离到500ml摇瓶(100ml培养体积)中。允许细胞再次生长到约2×106到2.5×106个细胞/ml后以1∶2分离到1L摇瓶(240ml培养体积)中。如通过用锥虫蓝染色确定的，培养物生活力保持高于90％。
用颗粒筛分器AccuSizer780/SPOS单颗粒光学筛分器每天监控细胞生长和聚集。对于培养物的聚集分布图，小于或等于100个细胞/团的50％读数给出最佳生长速率。使用锥虫蓝染料排阻和血细胞计数器测量培养物生活力。监控细胞团块大小允许确定培养条件，如培养基修饰和搅动速率的影响，以通过控制细胞聚集来最优化细胞生长。制备一式两份培养物并且改变一式两份培养物之一的培养条件的一个参数(如搅动速度)，并使用颗粒筛分器随时间推移监控聚集程度。此外，连续进行颗粒大小测量以确定传代培养时间表。颗粒筛分器给出等于细胞密度的细胞质量读数和所希望的参数内的聚集保持。用细胞质量读数确定何时分离培养物以及分离比。对于聚集分布图，小于或等于100个细胞/团的50％读数的保持给出了最佳生长速率。
对于在1L瓶中的培养物连续增殖，使用颗粒筛分器连续监控细胞并如上述对细胞传代培养。颗粒筛分器分析表明A549细胞倾向于在悬浮培养中的前几次传代中形成大团块。通过传代前停止搅动1到2分钟允许大团块沉降到摇瓶底部，从而可以通过移液从群体除去团块。以该方式传代培养物直到将聚集降低到希望的水平。希望的水平是如下水平，其中在1-2分钟后没有大团沉降到培养瓶的底部并且使用颗粒筛分器的50％细胞读数小于或等于100个细胞/团。保持培养物生长速率。观察到的生长速率为至少0.3天-1。适应在无血清并且无动物材料的培养基悬浮生长的细胞可以称作“悬浮A549细胞”或者“适应的A549细胞”或者“A549S”或者“ATCC编号PTA-5708”。
表2A549细胞对无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养的适应细节
表3.适应的A549细胞系的按比例放大以制备适应的A549细胞系悬浮细胞库#1的细节
实施例2比较来自悬浮培养的不同细胞系的A549细胞的细胞聚集的量在A549细胞的无血清且无动物材料的培养基悬浮适应以生产适应的A549悬浮细胞系期间，选择性保留不结合大细胞团的细胞。选择不附着到表面的细胞或细胞系的亚群并在无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中增殖。通过多轮选择富集所希望的细胞群体，所述选择通过停止培养物的搅动并允许大细胞团块沉降到瓶的底部并传代培养保持悬浮的细胞来进行。适应的A549细胞系的所得细胞比在相同悬浮培养基(见，例如，表3)中未适应的A549细胞聚集程度较低。
将A549贴壁细胞用胰蛋白酶消化，用培养基1(见表1)洗涤一次，然后接种到125ml摇瓶中20ml体积的培养基1或2(见表1)。细胞在振荡培养箱中生长6天，培养箱具有5％CO2气氛，温度为37℃，搅动速度为85rpm。
表3来自不同A549细胞系的培养物的比较
实施例3通过无血清且无动物材料的培养基悬浮培养的A549S细胞生产CRAV在定轨摇床上的锥形瓶中和在搅拌的罐式生物反应器中进行A549S细胞的病毒生产。在两种情况中，通过用病毒接种物感染培养物进行生产。
对于摇瓶中的病毒生产，通过将摇床置于组织培养培养箱中来维持温度(37℃)、CO2水平(5％)和湿度。悬浮A549细胞在感染前在无血清且无动物材料的培养基(培养基2，见表1)中以分批模式生长到约1.8×106到2.4×106个细胞/ml的密度。病毒接种前，通过离心，用无血清且无动物材料的培养基(培养基2，见表1)进行约90％最初培养物体积的培养基交换。以1×108个病毒颗粒/ml的终浓度接种病毒，等价于病毒颗粒与细胞的比为约(40到50)∶1。病毒接种后2小时，向培养物加入氯化钙以对培养物提供额外的1.6mM氯化钙。感染后约20小时，通过离心进行与补加了额外1.6mM CaCl2的无血清且无动物材料的培养基(培养基2，见表1)的另一90％培养基交换。在感染后24小时、48小时和72小时从每个培养物收集3ml培养物样品用于定量所生产的病毒的量。所生产的病毒的量为100×109到150×109vp/ml或者3×104到4×104vp/细胞。
对于在生物反应器中生产，搅拌的罐式反应器装备有内部旋转过滤器并装备有节距刀片叶轮。用加热毯使培养温度保持在37℃。溶解氧保持在40％的空气饱和。顶部空间中空气流速保持在0.1L/分钟。用来自摇瓶的细胞接种生物反应器罐，最初接种密度为在无血清且无动物材料的培养基(培养基2，见表1)中0.5×106个细胞/ml。在整个实验中搅动速率保持在120rpm。当细胞密度达到约1.8×106到2.4×106个细胞/ml时，进行用3.8L无血清且无动物材料的培养基(培养基2，见表1)的灌注。然后在灌注后立即以1×108个病毒颗粒/ml的终浓度接种病毒。如使用摇瓶的情况一样，感染后2小时向罐中的培养物加入额外的CaCl2(1.6mM)。感染后约20小时，进行用3.8L无血清且无动物材料的培养基培养基2(见表1)的另一次灌注。感染后用5％Na2CO3溶液保持pH高于6.9。如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)描述的用Resource Q柱测量病毒效价。
实施例4.无血清且无动物材料的培养基悬浮培养中适应的A549细胞系的稳定性在试验期间对A549S细胞连续传代6个月，并以预定时间间隔感染培养物等分试样以评估CRAV生产力。在培养物的整个生命中以相同方式重复进行这些感染实验。对体外培养物年龄评估生产力，所述体外培养物年龄表达为细胞世代数。
通常，生产宿主细胞系应该稳定足够的世代数以确保可按比例放大的过程，例如，稳定至少60代。首先，细胞培养物必须能够在所选的培养环境中长时间段地保持其生长。其次，在确定的培养物年龄结束时生产水平不应该显著变化。第三，在不同培养物年龄产生的生产质量应该是相当的。为了评估适应的A549细胞系的稳定性，监控生长速率和病毒生产速率的改变。通过将发生的世代(或者细胞分裂)数除以发生生长的天数可以得到生长速率(见表4)。这还可以表达为ln(细胞质量增加倍数)/(培养结束时时间-培养开始时时间(天数))。
数据表明适应的A549细胞在从冷冻的原种复苏到无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中时易于立即生长，如生长曲线的第一个数据点所示。这翻译成40％细胞生长/天。接着是生长速率的逐渐增加，直到在约60世代时达到表观平台。在培养物从冷藏的条件启动时，生长速率的最初增加在许多细胞系中是常见的。
对于A549S细胞，表4数据中平均生长速率的范围为0.19到0.69(天-1)，22个数据点的平均值为0.42(天-1)。这对应于24到88小时的倍增时间(小时)的范围，其从平均生长速率(天-1)以公式(0.693×24)/平均生长速率计算，且平均倍增时间为40小时。
在继续培养以测量它的生长速率时，分离卫星培养物并用腺病毒载体感染以评估病毒生产。对于卫星培养物，允许A549S细胞在感染前生长到约1.8×106到2.4×106个细胞/ml。在病毒接种前，用新鲜培养基(培养基2，见表1)进行约90％的最初培养体积的培养基交换。以终浓度1×108vp/ml接种病毒。感染后约2小时，向培养物加入氯化钙(800μM)。感染后约20小时，进行用补加了800μM氯化钙的生长培养基(培养基2，见表1)的另一次90％培养基交换。在感染后24、48和72小时收集感染的培养物样品以用于定量生产的病毒。如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)中描述的用Resource Q柱测量病毒效价。在所有情况中感染后约48小时实现最大病毒效价。病毒生产力以表4中的体积生产力(volumetric productivity)给出。表4中的体积病毒生产力的范围为3.63×1010到1.44×1011(vp/ml)。表4中21个数据点的平均体积病毒生产力为8.21×1010(vp/ml)。
表4来自适应的A549细胞系的A549S培养物的稳定性结果
实施例5A549悬浮细胞的冷藏用含有血清的培养基(培养基5，见表1)和无动物材料的冷冻培养基(培养基4，见表1)进行A549悬浮细胞库的冷藏。如实施例1中描述的培养细胞。按照“Culture of Animal Cells”，R.I.Freshney，Wiley & Sons Inc.，NY，2000，PP.297-308中描述的标准方案制备冷冻细胞库。对于无动物材料的库，冷冻培养基使用培养基4(见表1)。对于含有血清的库，使用培养基5(见表1)。
来自两个库的解冻细胞容易地悬浮生长而不必再次适应。解冻后两个库的生长速率非常相当(见，例如，表5)。两个库的随后病毒生产力也没有受到无血清的冷藏的影响(见，例如，表6)。来自细胞库的瓶在37℃水浴中解冻，通过离心用培养基2(见表1)洗涤1次，然后使用20ml培养基2(见表1)接种到125ml摇瓶。如实施例4中给出的计算生长速率。如实施例4中关于卫星培养物描述的进行感染。
表5来自冷藏的A549S细胞系的A549S培养物的细胞生长
表6来自冷藏的A549S细胞系的A549S培养物的病毒生产
实施例6A549细胞的悬浮适应之前和之后CRAV生产的比较在相同条件下，在含有血清的培养基(培养基1，见表1)和在静止培养皿中，使用适应的A549细胞系(A549S)的A549细胞或者来自贴壁培养的A549细胞进行感染。以一式两份进行感染培养。
将来自生长在培养基2(见表1)的无血清且无动物材料的培养基悬浮培养的适应的A549细胞以80％到100％汇合接种在几个T-25培养瓶中的培养基1(见表1)中并允许附着到瓶表面24小时。将完全作为贴壁培养(非适应的)生长的A549细胞在感染前接种在几个T-25瓶中4天并允许在培养基1(见表1)中生长到80％到100％汇合。感染时，将来自两种细胞系的培养物用培养基1(见表1)进行交换并用CRAV以1×108或4×108vp/ml感染。感染后24小时，除去病毒接种物并用新鲜培养基1(见表1)替换。此外，在感染后24小时对每种细胞系取一个代表性瓶，用胰蛋白酶消化，并通过血细胞计数器计数和锥虫蓝染色测定每个瓶的细胞数。在感染后第2和第3天，来自每个细胞系的瓶在-80℃冷冻并处理用于Resource Q HPLC分析。将培养物生产的病毒的总量除以感染后24小时存在的细胞数以确定两种细胞系的比生产力。使用含有10％FBS的DMEM(见表1，培养基1)在静止培养皿中对悬浮适应的细胞A549S进行感染，所述DMEM是用于贴壁培养的制剂。基于每个细胞，与未适应的对照A549细胞相比，A549S细胞没有显示出病毒生产水平的降低(见，例如，表7)。
表7使用静止培养的感染条件用含有血清的培养基，对未适应的贴壁A549细胞与A549S细胞的比病毒生产力的比较
实施例7.氯化钙加入对无血清并且无动物材料的悬浮培养的A549S细胞中CRAV生产的影响在摇瓶中评估氯化钙加入对CRAV生产的影响。对于摇瓶中的病毒生产，通过将摇床置于组织培养箱中来维持温度(37℃)、CO2水平(5％)和湿度水平。悬浮A549S细胞在感染前在无血清并且无动物材料的培养基(培养基2，见表1)中以分批模式生长到约1.8×106到2.4×106个细胞/ml的密度。病毒接种前，用无血清并且无动物材料的培养基(培养基2，见表1)通过离心进行约90％的最初培养物体积的培养基交换。病毒以终浓度1×108个病毒颗粒/ml接种，相当于病毒颗粒与细胞的约(40到50)∶1比。
病毒接种后(感染后)约2小时，向培养物加入氯化钙溶液以实现靶氯化钙(除了培养基中已经含有的钙量之外)浓度为200μM到1600μM，具体地是下面的氯化钙浓度200μM、400μM、800μM和1600μM。其次，用含有与感染后2小时进行的氯化钙加入相同的量的额外氯化钙的新鲜培养基2在感染后约20小时通过离心进行培养基灌注。包括对照培养物，其中在感染后2小时不加入氯化钙或者在感染后20小时用新鲜培养基2(见表1)灌注。对于每种培养物在感染后48小时收集3ml培养物样品以定量所生产的病毒。如Shabram，等人Human Gene Therapy 8453-465(1997)中描述的通过Resource Q HPLC测量生产的病毒的量。结果在表8中显示。
表8氯化钙加入对在无血清并且无动物材料的悬浮培养中培养的A549S细胞中CRAV生产的影响
实施例8.病毒接种物浓度对CRAV生产的影响在摇瓶中用A549S细胞检查病毒接种物浓度对CRAV生产的影响。使来自冷冻库的A549S细胞解冻并在培养基2(见表1)中传代直到它们显示出稳定生长。两个1升摇瓶培养物生长到约2.7×106个细胞/ml的浓度并合并培养物。通过离心对约85％的最初培养物体积进行培养基交换，并将细胞重悬浮到约3.6×106个细胞/ml的最终细胞密度并等分试样到14个125ml摇瓶中。然后将细胞用浓度为0.125×108vp/ml到8×108vp/ml的CRAV病毒接种(见表9)；对每种浓度进行一式两份的感染。接种的细胞在37℃，5％CO2和高湿度下生长在组织培养箱中。在感染后2小时，向每个培养物加入氯化钙以向培养物提供额外的1.6mM氯化钙(CaCl2)。感染后约20小时，用补加了1.6mM CaCl2的培养基2(见表1)进行另外85％培养基交换。在感染后24、48、72和96小时从每个培养物收集3ml样品用于定量所生产的CRAV病毒。表9显示，到感染后第3或4天，在来自以0.5×108vp/ml到8×108vp/ml感染的培养物的病毒效价中有很小差异。
表9在不同病毒接种物浓度下A549S培养物的CRAV病毒生产；值是一式两份样品的平均值。
本发明的范围不应受到本文描述的特定实施方案的限制。实际上，除了本发明描述的之外，根据前面的描述，本发明的多种修改将对于本领域技术人员是显而易见的。此类修改落入所附权利要求
的范围内。
在本申请全文引用专利、专利申请、出版物、产品说明书和规程，它们的公开内容在此完整引入作为参考。
权利要求
1.在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中稳定的适应的A549细胞系。
2.权利要求
1的细胞系，其中所述适应的A549细胞系是鉴定为ATCC编号PTA-5708的细胞系。
3.使A549细胞适应无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养的方法，其包括步骤(a)在贴壁培养中使细胞从含有血清的培养基断奶到最终血清浓度为2.5％到低于1.25％的培养基；(b)将细胞引入悬浮培养；(c)监控细胞聚集；(d)除去细胞团块；和(e)继续使悬浮培养中的细胞断奶到没有血清的培养基。
4.权利要求
3的方法，其中所述A549细胞是ATCC株系CCL-185。
5.生产在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中稳定的适应的A549细胞系的方法，其包括步骤(a)通过根据权利要求
3的方法适应A549细胞；和(b)在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中培养所述细胞。
6.权利要求
5的方法，其还包括在0℃或更低温度下保存细胞。
7.权利要求
5的方法，其还包括冷藏细胞。
8.生产病毒的方法，其包括步骤(a)在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中培养权利要求
1的适应的A549细胞系的A549细胞；(b)用病毒接种细胞；和(c)温育接种的细胞。
9.权利要求
8的方法，其还包括在步骤(c)后冷冻细胞。
10.权利要求
8的方法，其还包括在步骤(c)后收获病毒。
11.权利要求
10的方法，其中从细胞和培养基收获病毒。
12.权利要求
8的方法，其中所述病毒是腺病毒。
13.权利要求
8的方法，其中所述病毒是重组病毒。
14.权利要求
8的方法，其中所述病毒携带异源基因。
15.权利要求
12的方法，其中所述腺病毒是条件复制的腺病毒。
16.权利要求
8的方法，其还包括在步骤(b)后向培养物加入氯化钙。
17.权利要求
8的方法，其中在病毒接种时A549细胞浓度为1.8×106个细胞/ml到2.4×106个细胞/ml。
18.权利要求
12的方法，其中所述接种的腺病毒的量为1×108个病毒颗粒/ml培养基。
19.权利要求
12的方法，其中接种时病毒颗粒与细胞的比率为(40到60)∶1。
20.权利要求
8的方法，其还包括在步骤(a)后和步骤(b)前将所述培养基与新鲜培养基交换。
21.权利要求
8的方法，其还包括在步骤(c)后，步骤(d)将所述培养基与新鲜培养基交换；和(e)温育所述细胞。
22.权利要求
8的方法，其还包括在步骤(a)后和步骤(b)前；和步骤(c)后将所述培养基与新鲜培养基交换。
23.权利要求
8的方法，其中所述A549细胞来自冷藏的细胞系。
24.权利要求
8的方法，其中所述A549细胞来自适应于无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养的细胞系。
25.生产腺病毒的方法，其包括步骤(a)在贴壁培养中使A549细胞从含有血清的培养基断奶到最终血清浓度为2.5％到低于1.25％的培养基；(b)将细胞引入悬浮培养；(c)监控细胞聚集；(d)除去细胞团块；(e)继续使悬浮培养中的细胞断奶到没有血清的培养基；(f)增殖细胞到晚期指数生长期；(g)将所述培养基与新鲜培养基交换；(h)用腺病毒接种所述细胞；(i)向培养物加入氯化钙；(j)温育接种的细胞；(k)将所述培养基与新鲜培养基交换；(l)温育细胞；(m)向培养物加入氯化钙；(n)温育细胞；和(o)收获腺病毒。
26.权利要求
25的方法，其在步骤(e)后但是在步骤(f)前还包括步骤(i)浓缩细胞；(ii)将所述培养基与补加冷冻保护剂的培养基交换；(iii)冷冻细胞；(iv)将细胞保存在0℃或更低的温度下；和(v)将细胞重构到无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中。
专利摘要
本发明提供了使细胞，如A549细胞适应在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中生长的方法。本发明提供了从适应在无血清并且无动物材料的培养基悬浮培养中生长的A549细胞制备病毒，如腺病毒的方法。
文档编号C12N15/861GKCN1898379SQ200480038524
公开日2007年1月17日 申请日期2004年12月21日
发明者Z·刘, R·L·小龙利, M·P·桑托洛, M·沃洛奇 申请人:先灵公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan