专利名称：:石豆兰提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有抑制NO生成活性的石豆兰提取物及其制备方法。
背景技术：
：困扰人们的日常炎性疾病包括，关节炎症例如骨关节炎、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风关节炎等；炎性皮肤病例如湿疹、牛皮癣、皮炎等；炎性眼疾例如眼色素层炎、结膜炎等；肺部疾病例如哮喘、支气管炎、急性呼吸窘迫综合症等；菌血症、那毒素血症、口疮溃疡、龈炎、胰腺炎等；胃肠道疾病例如节段性回肠炎、萎縮性胃炎、溃疡性结肠炎、腹腔炎、消化性溃疡、应激性肠道综合症例如由幽门螺旋杆菌感染而引起的粘膜炎症或者由非甾体类抗炎药引起的肠胃病等等。有关各种炎症致病作用的机理是已知体内一氧化氮(N0)是介导细胞免疫和炎症的毒性物质。其前体是左旋精氨酸(L-arg)，L-arg末端胍基上的2个相同的氮原子之一在N0合成酶(N0S)的作用下生成N0。目前已经分离出三种不同类型的NOS，包括内皮NO合成酶(eN0S)，神经元N0合成酶(nN0S)及诱导型NO合成酶(iN0S)。目前已知，巨噬细胞、肝细胞、平滑肌细胞、腺癌细胞以及上皮细胞均能表达iN0S。某些炎性细胞因子和微生物产物如脂多糖(LPS)则可诱导iN0S表达。iNOS—旦被诱导即可表达出高度活性，产生大量N0。因此，长时间以来，人们致力于寻找N0合成酶的抑制剂来治疗与之相关的炎性疾病。但这些抑制剂大多局限于化学合成的物质，副作用较大。现有技术中未见从天然中草药植物中提取抗炎活性物质的报道。石豆兰(BulbophgllumradiatumLindl)，兰科植物，主要分布于中国长江以南的地区。在中国民间使用其新鲜植物(常用量820g)，具有平喘、活血、消肿止痛、治疗四肢麻痹等抗炎作用。但迄今为止，对于石豆兰的化学成分及生物活性的研究报道较少。在中国专利公开号为CN1458154A"—种新的抗肿瘤化合物石豆兰酚甲"中公开了一种化合物石豆兰酚甲(bulbophylolA)的结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>[0008]在中国专利公开号为CN1458155A"—种新的抗肿瘤化合物石豆兰酚乙"中公开了一种化合物石豆兰酚乙(bulbophylolB)的结构式为在以上两个专利申请说明书中通过核磁共振分析了所公开的化合物的基本数据，并以体外培养的宫颈癌HeLa细胞为模型考察所公开的化合物的抗肿瘤活性。都没有涉及分离、确定石豆兰中的抗炎活性成分。因此本发明从石豆兰中提取具有明确抗炎活性的组分，其安全无毒，并能有效地抑制NO的生成，达到抗炎作用。发明公开本发明的发明目的是从药用植物石豆兰中提取具有明确抗炎活性的组分，其能有效地抑制NO的生成，达到抗炎作用。本发明提供了一种石豆兰提取物l，其具有如下的结构式石豆兰提取物l，其具有抑制NO生成的活性。本发明还提供了一种石豆兰提取物2，其具有如下的结构式OH(!)CH3石豆兰提取物2，其具有抑制NO生成的活性。本发明还提供了一种石豆兰提取物3，其具有如下的结构式石豆兰提取物3，其具有抑制NO生成的活性。本发明涉及一种从药用植物石豆兰(BulbophgllumradiatumLindl)中分离活性化合物的方法，其特征在于包含如下的步骤1)制备石豆兰的乙醇提取物；经过乙醇浸泡提取重复2次，合并这些提取液，经减压浓縮得到褐色粉末提取物；2)将该粉末提取物溶解在水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇作为洗脱液分别提取；6[0026]3)对步骤2)中的乙酸乙酯、石油醚洗脱液利用柱层析进行分离；4)对步骤3)中收集到的洗脱液进行减压浓縮，进一步分离精制；对步骤4)中分离得到化合物进行理化特性分析以确定其结构；对石豆兰提取物进行NO生成抑制活性和毒性测试。其中，优选石豆兰的乙醇提取液浓度是60%;其中，层析柱可以在硅胶柱或S印hadenLH-20柱中选择；而洗脱剂可以在氯仿甲醇(体积比为ioo:o，95:5，90:io，85:15，80:20，70:30，60:40，50:50，o:100)、或正己烷乙酸乙酯(体积比为ioo:o，95:5，90:io，85:15，80:20，70:30，60:40，50:50，o:100)、或正己烷丙酮(体积比为100:o，95:5，90:10，85:15，so:20，70:30，60:40，50:50，0:100)中选择。其中，减压浓縮优选是在4(TC条件下进行的。其中，精制的方法为使用HPLC，流动相甲醇_H20=1:l，流速4ml/min，在室温下制备；或HPLC(AQVSAILSS4251SenshuScientificCo、Ltd、10X250mm)，流动相正己烷丙酮=7:3，流速4ml/min。室温下制备。其中的理化特性分析技术包括核磁共振技术。其中，NO生成抑制活性测试是利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7通过griess法进行分析的。其中的毒性作用是通过匪T细胞毒性试验进行分析的。—种石豆兰提取物6，其特征在它具有如下的理化参数13C_NMR丄H-NMR性状无色油状1136.2sEI-MS(m/z)2722102.4d6.36d(2.2)HR-EI-MS(m/z)实测值272.10543148.7s计算值272.10494133.3s分子量272.15143.5s分子式CieHi6046107.6d6.37d(2.2)UV入ma/eOHnm(log￡)1'143.3s202(4.35)2'115.4d6.64m207(3.40)3'155.5s275(3.27)4'112.8d6.64mTDKBr—1IRv隨cm5'129.5d7.15t(7.6)3464,2950，6'121.0d6.78d(7.6)2858,2781，a37.9t2.81brs1632，1589a，37.7t2.81brs1350,9260CH356.5q3.85s0CH20101.2t5.82s7[0039]化合物6是从石豆兰中按照上述方法分离得到的—种石豆兰提取物7，其特征在它具有如下的理化参数<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>[0042]化合物7是从石豆兰中按照上述方法分离得到的。本发明还涉及上述石豆兰提取物1、2、3在制备治疗与NO生成相关的炎症的药物中的应用。本发明所取得的有益技术效果是首次从石豆兰中分离得到具有明确抗炎活性的提取物，其作为天然的NO生成抑制剂，克服了化学合成物质的毒副作用。最佳实施方式实施例1:提取物的制备与结构的确定1、石豆兰的提取物制备将9.5kg的石豆兰全草粉碎，加入60%乙醇(乙醇水=6:4)至55升，室温浸泡12小时，然后再加热回流1小时，得浸出液。其滤渣再一次用60%乙醇55升如上法提取，与上次提取液合并，在4(TC减压浓縮，得到260.3g褐色粉末。把全部的粉末萃取物溶解于2升水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各2升分3次萃取，这些萃取液中的乙酸乙酯萃取物4(TC下减压浓縮，得到32.6克的褐色粉末。将乙酸乙酯提取物32.6g上硅胶柱进行分离，洗脱剂分别为氯仿甲醇体积比(下同)=ioo:o，95:5，90:io，85:15，80:20，70:30，60:40，50:so，o:100，分别收集2升的洗脱液。收集氯仿甲醇=100:0的洗脱馏分，在4(TC下减压浓縮得到浓縮物4.7314g。将所得浓縮物进行硅胶柱层析，收集氯仿甲醇=90:10的馏分，4(rc减压浓縮，用正乙烷乙酸乙酯=90:IO重结晶，得无色针状结晶化合物式(1)(490mg)，未见文献记载。收集氯仿甲醇=90:10的洗脱馏分，40。C减压浓縮。利用S印hadenLH-20对浓縮物8.1625g进行分离，以氯仿甲醇=7:3为洗脱剂，每40ml为一馏分，收集第18至25馏分，4(TC减压浓縮，得0.9056g浓縮物，然后上制备HPLC，流动相甲醇H20=1:1，流速4ml/min，在室温下制备。紫外检测波长254nm。收集保留时间分别为16分42秒与23分11秒的峰，每瓶5ml4(TC减压浓縮收集的馏分，分别得无色针状结晶化合物2(21.8mg)以及化合物3(22.lmg)。两个化合物均未见文献报道。收集乙酸乙酯萃取物的氯仿甲醇=90:io的洗脱液，在4(rc减压浓縮，得到浓縮物8.1625g上S印hadenLH-20(PharmaciaBiochem，7X15cm)进行柱层析，以氯仿甲醇=1:1作为洗脱剂，每40ml为一个馏分。收集第21至42的馏分，4(TC减压浓縮。将所得的1.0832g浓縮物上HPLC(AQVSAILSS4251SenshuScientificCo、Ltd、10X250mm)，流动相正己烷丙酮=7:3，流速4ml/min;室温下制备；紫外检测波长254nm，收集保留时间分别为8分15秒、13分24秒、18分14秒的流分。40°C减压浓縮收集液，得白色固体化合物4(11.6mg)。无色油状化合物5(12.lmg)以及无色油状化合物6(18.5mg)，化合物4(Majumder，P.LandBasak.M.，TwobibenzylderivativesfromtheorchidCirrhopetalumandersonii，Phytochemistry，30(1)，321-324(1991))及化合物5(Asahina，Hiroshi;Yoshikawa，Hiromichi;Shuto，Yoshihiro.EffectsofbatetesinIIIanditsanalogsongibberellicacid-d印endenta—amylaseinductioninembryolessbarleyseedsandoncressgrowth,Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,62(8)，1619-1620，(1998).)为已知化合物，化合物6未见文献报道。石油醚洗脱液浓縮得29.3g褐色粉末，进行硅胶柱(青岛海洋化工厂)层析，洗脱剂为正己烷乙酸乙酯=ioo:o，95:5，90:io，85:15，80:20，70:30，60:40，50:50，0:100，分别收集2升。4(TC减压浓縮95:5的洗脱液。将浓縮物1.2411g进行硅胶(青岛海洋化工厂)柱层析，洗脱剂为正己烷丙酮=ioo:o，95:5，90:io，85:15，80:20，70:30，60:40，50:50，0:100，各收集300ml，40。C减压浓縮90:10洗脱部分的第23至29馏分。将0.2101g浓縮物在正己烷与丙酮的混合溶剂中重结晶，得白色结晶化合物7(21.4mg)。化合物7未见文献报道。2、确定结构式化合物1-7的性状见表1，13C_NMR与力-NMR的数据见表2。并由以上数据最终确定了化合物的结构式。表1化合物1-3的性状化合物1化合物2化合物39<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[0058]表2化合物1-7的NMR数据(ppm、CDC13、500MHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[0060]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>[0064]表2续<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中化合物1-3的结构确定如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>123实施例2抑制NO生成的活性由于干扰素r以及脂多糖剌激而产生的巨噬细胞对NO生成的阻碍效果(抑制NO生成的效果)通过下面的实验方法求得。并且根据阻碍效果的IC5。(um)来评价NO生成的抑制效果。[0073]所用材料RAW264.7细胞(大日本制药)N-l-盐酸萘乙二胺(lg和光纯药)磺胺(500g和光纯药)Ham'sF12培养基(SIGMAN488500mL)IFN_Y(Geneyme/Techne100lig)脂多糖(LPS,055:B510mg，Sigma)磷酸(500ml和光纯药)DMSO(500ml和光纯药)96孔微滴定板(50/盒住友电木，商品名〔8096R〕)微滴定板记数器(BIO-RAD3550)NO生成抑制活性的试验方法调整RAW264.7细胞的浓度至1-5X105个/ml，分注于96孔板，每孔2Q0ul，置于(A孵箱中，传代l个小时。加入检体后，加入脂多糖2ul。在C0J桴箱中培养16小时。调整最终浓度至干扰素r(IFN-r)O.33ng/ml，LPS100ng/ml。将检体溶解于DMSO，调整含量至0.2%。在显微镜下观察细胞并进行MTT实验。细胞毒性通过MTT法、由镜检确定。MTT法是已知的常规方法。S卩，于96孔微滴定板，每孔200iU细胞浓度为1.0Xl()5细胞/ml，添加不同浓度的提取物或单体组分，将细胞培养16小时，加入MTT试剂，再培养4小时。弃上清，添加150iUDMSO，将生成的甲臜(formazane)完全溶解，测定570nm下的吸光度。利用griess法进行NO生成评价。取上清100ul，加入0.1%N-l-盐酸萘乙二胺(N-l-N即hthyethylene-diamineDihyrochloride)溶液50ul，对胺基苯磺酰胺溶液50ul，室温放置10分钟。用分光光度计测570nm的0.D.值。在STD中，用亚硝酸钠溶液(100，50，20，10，5，2，1，Oum)。供试药用注射用水溶解。活性评价计算出N02—的量，代入下面的公式求出抑制效果抑制效果(％)={1-(X-Y)/(Z_Y)}X100X:在实验化合物存在下，由IFN-Y和LPS诱导产生的N02—的量，Y;在实验化合物、IFN-Y和LPS均不存在的情况下，诱导产生的N02—的量，Z:IFN-Y禾PLPS诱导产生的N02—的量。[0095]NO生成抑制效果的IC5。如下所示表3石豆兰浸膏及萃取物的NO生成抑制试验的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>水层浸膏表4单体的NO生成抑制试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求一种石豆兰提取物1，其特征在于具有如下的结构式F2004800422775C00011.tif2.—种石豆兰提取物2，其特征在于具有如下的结构式3.具有如下结构式3的石豆兰提取物在制备治疗与NO生成相关的炎症的药物中的用途4.一种从药用植物石豆兰中分离活性化合物的方法，其特征在于包括如下的步骤1)制备石豆兰的乙醇提取物；经过乙醇浸泡提取重复2次，合并这些提取液，经减压浓縮得到褐色粉末提取物；2)将该粉末提取物溶解在水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇作为洗脱液分别提取；3)对步骤2)中的乙酸乙酯、石油醚洗脱液利用柱层析进行分离；4)对步骤3)中收集到的洗脱液进行减压浓縮，进一步分离精制；其中，石豆兰的乙醇提取液浓度是60%;其中，层析柱为硅胶柱或S印hadenLH-20柱；洗脱剂为体积比为100:0、95:5、90:io、85:15、80:20、70:30、60:40、50:50或0:ioo的氯仿和甲醇；体积比为ioo:o、95:5、90:io、85:15、80:20、70:30、60:40、50:50或0:ioo的正己烷乙酸乙酯；或体积比为ioo:o、95:5、90:io、85:15、80:20、70:30、60:40、50:50或o:ioo的正己烷丙酮；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，减压浓縮在4(TC条件下进行；其中，精制的方法为使用HPLC，流动相为甲醇H20=1:1，流速4ml/min，在室温下制备；或HPLC，流动相为正己烷丙酮=7:3，流速4ml/min。5.—种石豆兰提取物6，其特征在它具有如下的理化参数<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>6.—种石豆兰提取物7，其特征在它具有如下的理化参数<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>7.如权利要求1中所述石豆兰提取物1或权利要求2中所述石豆兰提取物2在制备治疗与NO生成相关的炎症的药物中的应用。专利摘要本发明公开了一种从药用植物石豆兰中提取分离抑制NO生成活性的化合物的方法，包括步骤有制备石豆兰的提取物；对上述提取物利用柱层析进行分离，收集洗脱组分；对收集到的洗脱馏分进行减压浓缩，进一步分离精制；对精制得到的化合物进行理化特性分析以确定其结构；并进行NO生成抑制活性和毒性测试。发现精制得到的化合物具有抑制NO生成的活性。其中化合物1-3的结构确定如下。文档编号C07D493/04GKCN1976937B发布类型授权专利申请号CN200480042277公开日2010年4月28日申请日期2004年3月4日发明者北中进,姚新生,张家欣,王乃利,王珏申请人:学校法人日本大学;王导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan专利引用(2),非专利引用(2),