专利名称：:能产生耐蛋白酶细菌素的乳酸菌及其培养物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及l)一种含细菌素的乳酸菌培养物的生产方法，2)用含细菌素的乳酸菌培养物保存食品的方法，3)能够产生细菌素的乳酸菌的筛选方法。
背景技术：
：为了防止食品的腐败和品质退化，在各种食品中加入食品防腐剂。这样的食品防腐剂，迄今为止主要是使用化学合成的食品防腐剂。然而，化学合成食品防腐剂有时会涉及对光的安全性问题，例如持久性或毒性。为了解决这个问题，人们期望开发出来源于传统食品的安全的抗菌物质。同时，乳酸菌是传统上己经用于生产各种发酵食品(包括发酵饮料)，例如酱油、豆瓣酱(H本豆酱)、泡菜和日本清酒等的有用的微生物。另外，乳酸菌已被用于生产发酵食品的加工。这归因于，由于通过乳酸发酵而产生乳酸从而体系的pH降低，因此抑制了存在于生产过程和最终产品中的污染菌的生长，从而能防止这些食品腐败和品质退化。另外，己经证明，由乳酸菌产生的抗菌物质对于防止食品的腐败和品质退化也有用。抗菌物质中，由各种细菌产生的蛋白质抗菌物质被称为细菌素。由乳酸菌产生的各种细菌素中，乳链菌肽是被美国食品药品管理局(FDA)批准的公认安全(GRAS)物质，同时也被世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)批准的具有抗菌活性的安全物质。此外，乳链菌肽在全世界50多个国家被用作为食品防腐剂。然而，不利的是，包括乳链菌肽在内的已知的各种细菌素与蛋白酶在一起很容易分解。换句话说，在生产像清酒、酱油和豆瓣酱(日本豆酱)等发酵食品的过程中，细菌素很容易被由米曲霉等产生的蛋白酶分解。所以细菌素不能维持满意的抗微生物活性。例如，据报导，在清酒的巴斯德氏灭菌法之前加入乳链菌肽的情况下(公开No.JP06另外，经过处理的肉类产品，例如火腿和香肠，是由于存在于其原材料自身的微生物或在生产过程中污染微生物而自然发酵，因此可以赋予更好的风味和可保存性。为了稳定产品质量、缩短生产周期和防止有害微生物的生长，目前，己经丌发了起子培养物方法(乳酸菌科学技术，联合出版中心，1996年，239页)。例如，Chung等人披露了在乳链菌肽溶液中浸渍未煮过的肉的效果或在预先注射特定菌种的新鲜的可食用肉上放置乳链菌肽的效果。根据报告，用于新鲜的食用肉的乳链菌肽很快就失去了活性(Env.Microbiol.55:(6)1329为了防止类似上述乳链菌肽的酶分解，一项包括热处理食用肉、随后将诸如乳链菌肽的羊毛硫氨酸基细菌素施于热处理食用肉的表面上的发明被报道(公开号JP06-22685)。然而，食用肉在加入乳链菌肽之前应该加热处理。因此，该发明的使用范围多少受到限制。目前在食品工业上，迫切要求提供适用于各种食品包括发酵食品和经加工的肉类制品的抗蛋白酶细菌素。
发明内容如上所述，乳酸菌传统上已经用于处理各种食品包括发酵食品，而且从来没有引起任何安全问题。另外，由乳酸菌产生的抗菌物质被认为比化学合成物质安全。因此，本发明的目的是提供l)一种含细菌素的乳酸菌培养物的生产方法；2)用含所述细菌素的乳酸菌培养物保存食品的方法；和3)能够产生抗蛋白酶细菌素的乳酸菌的筛选方法。为了解决这个课题，发明人对存在于诸如发酵牛奶等发酵食品中的乳酸菌进行了分离，并筛选了产生新的抗蛋白酶细菌素的菌株。因此，发明人成功地分离了产生那种物质的乳酸菌。发明人证实，由所述菌株产生的细菌素是新物质。以下详细描述本发明。(1)一种含抗蛋白酶的细菌素的乳酸菌培养物的生产方法。(2)如(1)所述的方法，其中，乳酸菌属于Weissella、小球菌属、乳杆菌属或白联珠菌属中的任何一个属。(3)在(2)中所述的方法，其中，属于Weissella属的乳酸菌是WeissellacibariaJCM12495，WissellaconfusaJCM1093、WeissellahdlenicaJCM10103、WeissellakandleriJCM5817、WeissellaminorJCM1168、WeissellaparamesenteroidesJCM9890或WeissellathailandensisJCM10694中的任何一个。(4)在(2)中所述的方法，其中，属于小球菌属的乳酸菌是戊糖片球菌。(5)在(2)中所描述的方法，其中，属于乳杆菌属的乳酸菌是植物乳杆菌、Lactobacillussalivarius或Lactobacilluspentosus中的任何一个。(6)在(2)中所描述的方法，其中，属于白联珠菌属的乳酸菌是Leuconostoccitreum、Leuconostocpseudomesenteroides、Leuconostocargentinum、Leuconostoccarnosum或Leuconostocmsscntsroicks中的任何一个o(7)—种保存食物产品的方法，其中，(1)至(6)中任何一个所述的乳酸菌培养物被用于食品的生产过程。(8)如(7)中所述的方法，其中，食品为发酵食品或加工过的肉类制品。(9)一种筛选产生细菌素的乳酸菌的方法，其包括筛选所述细菌素即使在蛋白酶存在的情况下也具有抗菌活性的乳酸菌培养物的步骤。以下详细描述本发明。在亚美尼亚，通常也作为一个长寿国家为人所知，现在已经知道了大量传统上配制给病人的健康食品。例如，食品包括诸如Matsoon和Narine、干杏、红葡萄酒、jyesiin和tiinaff的乳酸食品。发明人将注意力主要集中在亚美尼亚人们食用的发酵牛奶Matsoon和作为发酵食品原料的清酒曲(koji)上，展开研究工作。在本发明中，"具有蛋白酶耐性的细菌素"或"耐蛋白酶细菌素"是指即使在有来源于米曲霉的蛋白酶存在的情况下仍然具有抗菌活性的细菌素。也包括其抗菌活性会被淀粉酶降低的细菌素。乳酸菌培养物，包含"具有蛋白酶耐性的细菌素"或"耐蛋白酶细菌素"，是指形成指示菌株抑制区的培养物，在下述方法中将作具体说明(1)根据普通的培养法(或用于分离微生物的培养法)配制乳酸菌培养物。用氢氧化钠溶液调节乳酸菌培养物的pH至pH5.5—6.0。随后，在12,000rpm转速下将培养物离心10分钟，用一次性注射器过滤装置"Dismic(2)使用ListeriainnocuaATCC33090T、BacilluscirculansJCM2504T、BacilluscoagulansJCM2257、MicrococcusluteusIFO12708、BacillussubtilisJCM1465T、BacillussubtilisIAM1381、Lactococcuslactissubsp.LactisATCC19435、EnterococcusfaeciumJCM5804T、EnterococcusfaeciumJCM5803T、LactobacillusplantarumATCC14917T禾卩LactobacillussakeiJCM1157T作为指示菌株，通过后述菌苔上点样法(SPOT-ON—LAWN)或菌落形成单位数的测定来选择具有最强抗菌活性的指示菌。(3)酶，使用来源于曲霉(UMAMIZYMEG，AmanoEnzymeCo)的蛋白酶。(4)在如(1)所述的样品中添加IO至100unit/ml的(3)所述的蛋白酶，在30。C下反应1小时以上。(5)将表现出(2)中所述的最强抗菌活性的指示菌株涂在中厚板上，例如指示菌可以生长的MRS中厚板，在中厚板的中心处滴下0.01毫升如(4)所述的蛋白酶处理过的样品，在适合指示菌生长的最适温度下(对于Listeriainnocua，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，Enterococcusfaecium或Pediococcuspentosaceus是37°C,对于其他菌是30°C)培养20至24小时。然后，可以观察到指示菌的抑制区。，本发明的能够产生耐蛋白酶的细菌素的乳酸菌是从发酵食品等中分离出来的。当然，也可以使用通过下述筛选方法获得的具有抗菌活性的乳酸菌。换言之，任何产生耐蛋白酶的细菌素的乳酸菌都适宜使用，而对于从哪种菌中分离出来的没有特殊的限制。根据发明人研究的结果，发现乳酸菌当中，Weissella属、小球菌属(Pediococcus)、Lactobacillus属、Leuconostoc属等产生所期望的耐蛋白酶细菌素。不言而喻，除上述以外，只要是能够产生耐蛋白酶细菌素的乳酸菌，都可以使用。通过在生产酱油、味噌和鱼酱等各种发酵食品以及火腿、香肠等各种加工过的肉制品的工艺中使用含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物，所述含耐蛋白酶细菌素的培养物是通过培养能够产生耐蛋白酶细菌素的乳酸菌而得到的，这样就可以防止目标食物的腐败和品质退化。细菌素可以分离后使用。或者，也可以不需分离直接将包含细菌素的培养物用作细菌素。由于分离等纯化过程通常很麻烦，所以优选将乳酸菌培养物本身添加到生产各种发酵食品的工艺中。此外，含有耐蛋白酶细菌素的培养物在生产发酵食品、加工过的肉制品等的工艺中可以添加一次或多次。细菌素或液体培养基被分成多少份添加可以自由决定。为获得预期的包含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物，乳酸菌应该被培养。培养条件，例如培养温度、培养次数、培养方法和培养基可以选择通常用来培养乳酸菌的培养条件。另外，凝胶过滤等常规的分离和纯化方法也可以用来分离。本发明的乳酸菌培养物是指含有被培养的乳酸菌的培养基或通过离心等除去所培养的乳酸菌的培养基。培养基可以是液体、固体或凝胶状物。当使用液体培养基时，有时也写成乳酸菌培养液。当然，乳酸菌培养物包括乳酸菌培养液。另外，本发明的乳酸菌培养物包括，通过喷雾干燥、冷冻干燥等得到的液体乳酸菌培养物的干粉，通过过滤、蒸发等得到液体乳酸菌培养物的浓縮液或糊状物，通过凝胶过滤、层析法等得到的具有抗菌活性的液体乳酸菌培养物的一部分。含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物可以被添加到任何食品中，对比并没有特殊的限制。最好为，将培养物添加到在生产过程中引入微生物的发酵食品和加工过的肉制品中。发酵食品包括酱油、鱼酱、清酒、豆瓣酱、味噌、泡菜、乳酪等。这些只是一部分例子，含有耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物可以用于除上述例子之外的食品中。发酵食品中，一直以来使用氯化钠作为抑菌剂。由于近年来对低盐饮食需求的增加以及通过在发酵作用中降低盐或除去盐可以加快蛋白质分解速率的优势，已经开展了在发酵食品中使用诸如乳链菌肽的细菌素的研究工作。然而，由于乳链菌肽和各种细菌素被存在于生产过程中的蛋白酶分解，所以目前还没有观察到抑菌力。在这样的生产发酵食品的工艺中，也可以使用含有耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物。另外，加工过的肉制品包括，例如火腿和香肠。当然，这只是举一些例子。含有耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物可以用于除上述例子之外的食品中。添加了包含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物的食品，例如发酵食品和加工过的肉制品等，具有非常高的耐存储性。在以下的实施例中，描述作为本发明的一个重要方面的产生耐蛋白酶细菌素的乳酸菌的筛选方法，在这些实施例中，乳酸菌是从发酵食品Matsoon中分离出来的。将从发酵食品之一的发酵牛奶Matsoon中收集的样品在乳酸菌能够生长的培养基中培养，所述培养基有例如MRS培养基(表1)或M17培养基(表2)，培养温度为30'C至37'C，放入培养基的样品量是0.5%。培养天数为l天、5天或10天。培养结束后，将培养液涂布在包含0.5%碳酸钙的琼脂培养基(琼脂1.2%)上并培养。从产生的菌落中收集乳酸菌。表l.MRS培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将收集的乳酸菌按前述方法培养。接着，将来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)蛋白酶的UmamizymeG(Amano酶公司)经过滤后添加到MRS琼脂培养基，在上述MRS琼脂培养基的平皿内接种并培养这些乳酸菌24小时。随后，将预先混合了指示菌株的LactobacilliAOAC培养基(表3)叠加在平皿上，培养24小时，形成指示菌株的抑制区。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>关于添加蛋白酶的方法，除了将蛋白酶混合在琼脂培养基内的方法外，还可以使用例如以下方法。1)将蛋白酶和指示菌株一起混合至培养基内的方法。2)在琼脂培养基上涂布蛋白酶的方法。3)在培养乳酸菌菌落时添加蛋白酶的方法，在这种情况下,蛋白酶可以在开始培养时、在培养期间内、或培养结束后添加。4)将样品适量滴在混合了指示菌株的培养皿上，观察抑制区形成的方法，其中，所述样品是在培养乳酸菌菌落、然后将培养液中的菌体灭菌或杀死之后，添加了蛋白酶的样品。再次说明，方法不局限于1)至4)所述的方法。另夕卜，蛋白酶不局限于UmamizymeG。然后，通过分析抗菌谱进行评价。采用菌苔上点样法(spot-on-lawn)在培养皿上点样具有抗菌活性的乳酸菌培养物的上清液，考察如下所述的抗菌活性，考查抗菌谱。首先配制具有抗菌活性的样品。将由上述方法获得的具有抗菌活性的菌株培养液在10,000rpm下离心10分钟，从而获得培养物上清液。然后通过过滤器过滤上清液来获得无菌样品。将样品每次稀释2倍，直至配制成稀释级数为2"的稀释系列。当活性比较低的情况下，在室温下每次将样品减压浓縮2倍，逐渐配制浓度级数至2—3。然后，培养欲混合在培养皿上来考査抗菌活性的指示菌株。在TSBYE培养基(表5和6)或MRS培养基上培养表4所示的指示菌株。杆菌属和小球菌属是用振荡器培养而其他菌是静置培养。另外，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、李斯特菌属(Listeria)、小球菌属(Pediococcus)和肠球菌(Enterococcus)在37'C培养而其他菌则在3(TC培养。表4.评价抗菌活性指示菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6.TSB培养基的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>此外，配制考查抗菌活性的平皿在12rC对10毫升MRS琼脂培养基(琼脂1.2%)和5毫升LactobacilliAOAC琼脂培养基(琼脂1.2%)分别灭菌15分钟，然后，保持温度55°C。将灭菌后的MRS琼脂培养基倾注在无菌的陪氏培养皿，然后放置在净化操作台上l小时。随后，将50ml的指示菌株培养液混合在LactobacilliAOAC琼脂培养基，保持温度为55。C。将培养液倾注在MRS平皿上。在净化操作台上打开平皿的盖子(大约15分钟)，干燥表面。将如上所配制的10pl每一种具有抗菌活性的样品滴加到平皿上。然后，盖上盖子，按照原样放置大约一小时，干燥平皿。在适宜于各个指示菌株的温度下培养平皿20小时，来考査抑制区的形成。这里，抗菌活性(AU/ml)定义如下抗菌活性(AU/ml)=(形成抑菌圈的最大稀释比)xi000/10按这种方式进行了抗菌谱分析的样品具有蛋白酶耐性，表现出广泛的抗菌谱。具伴实施方式现在结合以下实施例说明本发明。然而，本发明并不局限于这些实施例。实施例1预先培养来自典型培养物的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5890、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149、LactobacillussalivariusJCM1231，然后在MRS培养基(表l)中培养。菌株在37。C培养。在分别添加了表3所示的0U/ml(未添加)、200U/ml和400U/ml的UmamizymeG的MRS培养基上接种乳酸菌，培养24小时。培养是这样实施的在500毫升Sakaguchi烧瓶内装入100毫升MRS培养基，然后接种100ml每一种前培养液，在100次/分的振荡下振荡培养。接着，覆盖混合了Lactobacillussakei菌株JCM1157作为指示菌株的LactobacilliAOAC培养基。将这些平皿培养24小时。从而，形成指示菌的抑制区(表10)。结果表明每个菌株都产生耐蛋白酶细菌素。表10.产生PRB菌株的抑制区直径(毫米)<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Lactobacillussakeis加inJCMU57被用作指示菌株。表中的数值表示生长抑制区的直径。实施例230。C下在MRS培养基上培紫Lactock)ccuslactisNCD0497(乳链菌肽A产生菌)和LactococcuslactisNCIMB702054(乳链菌肽Z产生菌)。与实施例1同样的方法，用Lactobacillussakei菌株JCMl157作为指示菌株评价抗菌活性。另外，用1000IU/ml的乳链菌肽A溶液(ICNBiomedicalInc.(ICN生物医学公司))代替使用乳链菌肽产生菌，在MRS琼脂培养基平皿上点样10pl，评价抗菌活性。在没有蛋白酶的情况下，形成指示菌株的抑制区。在有蛋白酶存在的情况下，当蛋白酶浓度较高时(表ll)活性降低。表ll.不产生PRB菌株的抑制区直径(毫米)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>LactobacillussakeistrainJCMl157被用作指示菌株。表中的数值表示生长抑制区的直径。ND=未检出实施例3培养戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885、LactococcuslactisNCD0497(乳链菌肽A产生菌)禾卩LactobacillussakeiJCM1157菌株。在10，000rpm下离心培养液10分钟，来获得培养物上清液。向上清液添加2000U/mlUmamizyme、用酶处理24小时后，用过滤器(DISMIC25CS,ADVANTEC;0.45pm)过滤上清液，配制无菌样品。使用菌苔上点样法(spot-on-lawn)考查抗菌谱。结果，与乳酸菌肽产生菌的培养液和不产生细菌素的LactobacillussakeiJCMl157的培养液相比，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885即使在经过蛋白酶处理后仍然保持抗菌活性(表12)。这表明戊糖片球菌(PediococcuspentosaceusJCM5885)产生耐蛋白酶细菌素。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>培养液用蛋白酶处理后，用菌苔上点样法评价上清液。数值表示抗菌活性。抗菌活性(AU/ml)=(形成抑菌圈的最大稀释比)xlOOO/10,ND二未检出实施例4按照实施例3所述的方法，用酶处理戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCMl149、LactobacillussalivariusJCM1231、LeuconostoccitreumJCM9698、LeuconostocpseudomesenteroidesJCM9696、JCMl1045禾口LactococcuslactisNCIMB702054(乳链菌肽Z产生菌)菌株的培养物上清液。枯草杆菌(Bacillussubtilis)IAM1381被用作指示菌株。使用与实施例3同样的来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)的UmamizymeG作为酶。另夕卜，将来源于枯草杆菌(Bacillussubtilis)的a-淀粉酶(WakoPure化学药品有限公司)以100U/ml的量添加至乳酸菌培养液中，在3(TC使其反应一小时以上。然后，按同样的方法以枯草杆菌(Bacillussubtilis)IAM1381作为指示菌株，采用菌苔上点样法评价抗菌活性，研究a—淀粉酶对抗菌活性的影响。如表13所示，WeissellacibariaJCMl2495、WeissellaconfusaJCM1093、WeissellahellenicaJCM10103、WeissellakandleriJCM5817、WeissellaminorJCMl168、Weissellaparap^esenteroidesJCM9890、WeissellathailandensisJCMl0694、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCMl149、LactobacillussalivariusJCM1231、LactobacilluspentosusJCM1558、LeuconostoccitreumJCM9698、LeuconostocpseudomesenteroidesJCM9696、JCMl1045、LeuconostocargentinumJCMl1052、LeuconostoccarnosumJCM9695、禾口LeuconostocmesenteroidesJCM6124即使经过蛋白酶处理后仍然保持抗菌的活性。因此，发现这些菌株产生耐蛋白酶的细菌素。表」13.酶处理后的残存抗菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例5分别将大豆(10g)和纯水(10毫升)放进六个锥形瓶(体积200ml)，在高压锅内120°C下灭菌30分钟。冷却后，添加0.04g曲霉(kojimold)(酱油用紫色1NO.l菌)，3(TC下静置培养2天。将40毫升无菌纯水添加到培养样品(样品No.l)中，40毫升盐水添加至SampleNo.2中调整样品含盐量至18%，40毫升LactococcuslactisNCIMB702054(乳链菌肽Z产生菌)培养物上清液添加至样品No.3，40毫升PediococcuspentosaseceusJCM5885的培养物上清液添加至样品5，40毫升Lact6bacillssalivariusJCM1231的培养物上清液添加至样品6。用过滤器过滤过的6N盐酸和6NNaOH调节产物混合物至pH6.5—7.0。200pl在TSBYE培养基内3(TC下用振荡器振荡培养20小时的枯草杆菌IAM1381另外地接种、充分混合、30'C下培养。在培养的第1、2、7天，收集培养液在GAM琼脂培养基(GAM肉汤"NISSUI"，Nissui药物有限公司)上计算枯草杆菌IAM1381的活细胞数。在纯水样品中存在的污染菌枯草杆菌IAM1381为每克108细胞以上。在18%的含盐样品中没有发生污染。同时，在加入不含盐的乳链菌肽上清液的情况下，在第1天及以后乳链菌肽被来源于曲霉的蛋白酶分解。因此，产生每克108细胞以上的污染，没有观察到抗菌效果。然而，在使用PediococcuspentosaseceusJCM5885禾口LactobacillussalivariusJCM1231的上清液的情况下，从发酵的第1天ij第7天都没有观察到污染菌枯草杆菌IAM1381(表14)。表14.在酱油的生产工艺中使用细菌素代替盐的测试<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>PRB:耐蛋白细菌素工业实用性通过在发酵食品的生产过程中添加由例如戊糖片球菌、植物乳杆菌和Lactobacillussalivarius等产生的含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物，可以提供良好的保存食品的方法。权利要求1.能产生耐蛋白酶细菌素的乳酸菌，包括选自于LactobacillusplantarumJCM1149，LactobacillussalivariusJCM1231和LactobacilluspentosusJCM1558中的至少一种。2.含有耐蛋白酶细菌素的乳酸菌培养物，是如权利要求1所述的乳酸菌的培养物。3.添加了如权利要求1所述的乳酸菌和/或如权利要求2所述的乳酸菌培养物的食品。4.如权利要求3所述的食品，其特征在于，所述食品为发酵食品或加工过的肉制品。5.—种保存食品的方法，其特征在于，在食品的生产过程中添加如权利要求l所述的乳酸菌和/或如权利要求2所述的乳酸菌培养物。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述食品为发酵食品或加工过的肉制品。专利摘要本发明涉及含耐蛋白酶细菌素的乳酸菌及其培养物，在食品中使用所述乳酸菌及其培养物可以改进食品的耐存储性。文档编号A23B4/14GKCN101363007SQ200810149464公开日2009年2月11日申请日期2004年11月5日发明者上原章敬,取出恭彦申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan