专利名称:一种调控培养体系氧化还原电位提高丙酮酸产量的方法
技术领域：
一种调控培养体系的氧化还原电位提高光滑球拟酵母(rg/Wrato)丙酮酸
产量的方法，涉及辅因子代谢调控策略优化发酵过程技术领域：
。
背景技术：
丙酮酸又称2-氧代丙酸、a-酮基丙酸或乙酰基甲酸，是最重要的a-氧代羧酸之一，在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。多重营养缺陷型的7:g/Wmto，是目前唯一一个用于工业发酵法生产丙酮酸的微生物。丙酮酸是糖酵解的终端产物，和NADH代谢密切相关。研究表明，适当降低7: ^a6rato胞内NADH水平，增加NAD+供给，有利于加速糖酵解，提高丙酮酸产量。
利用生化工程和代谢工程策略可以方便有效的调控NADH和NAD+的形式及可利用性。代谢工程策略包括(l)过量表达NADH代谢相关的酶类；(2)删除NADH(NAD+)竞争利用途径；(3)引入NADH (NAD+)再生系统。而生化工程的方法包括在发酵液中补加(l)外源电子受体，如乙醛和富马酸等；(2)具有不同氧化态的碳源(山梨醇增加NADH可利用性，葡萄糖酸则降低NADH/NAD+比率)；(3)NAD+前体，是有效控制胞内NADH (NAD+)浓度的方式。此外其它的生化调控策略还有控制培养条件，例如增加溶氧水平和调节胞外氧化还原电位。
发酵培养基的氧化还原电位是反映各种环境条件的综合参数，依赖于培养基组份、pH、渗透压、温度和溶氧浓度等。研究表明，通过调节发酵培养基的氧化还原电位可以实现对工业微生物的代谢流分布、电子流向、多种酶/蛋白的生物合成以及胞内NADH水平的调控。因此氧化还原电位常被作为一个过程参数来提高目标代谢物的产量，例如拧檬酸、1，3-丙二醇、木糖和芳香类化合物。但是，通过氧化还原电位调节胞内NADH水平，从而提高7: g/Wrato糖酵解速率和丙酮酸产量，尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用氧化还原电位调控胞内NADH水平，提高7:g/a6rato丙酮酸产量的方法。
本发明的技术方案 一种调控培养体系氧化还原电位提高丙酮酸产量的方法，在光滑球拟酵母(7:g/Wmto)CCTCCM202019发酵培养基中，控制发酵培养基的溶氧浓度为20%，并在发酵培养基中添加外源电子受体铁氰化钾，提高培养基的初始氧化还原电位至400 mV，从而降低光滑球拟酵母CCTCC M202019胞内NADH水平，加速糖酵解，提高丙酮酸产量。
菌株光滑球拟酵母(7:g/Wrato)CCTCCM202019，烟酸(NA)、生物素(Bio)、 硫胺素(BD、吡哆醇(Pdx)等四种维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型 降低，为本研究室选育菌株，该菌种已申请中国专利，专利号ZL 02113142.2， 公开号为CN1392246A。
本发明的有益效果利用本发明能高效提高丙酮酸的产量。7 g/"6rato胞内 NADH浓度降低45.3y。，丙酮酸产量由49.6 g/L提高到61.9 g/L。本发明的氧化 还原电位调控策略对其它发酵产品的生产具有一定的指导意义。
具体实施方式
对照实施例
本发明所用的菌种为光滑球拟酵母(rora/o戸^ g/Wrato) CCTCC M202019， 先转斜面在30。C培养箱中培养24小时，然后在温度30。C、转速200 r/min进 行摇瓶培养24小时，最后在7 L发酵罐中进行发酵，发酵条件为pH5.5，搅 拌转速400 r/min，溶氧浓度20%。发酵培养基为(g/L):葡萄糖100，氯化铵7，乙 酸钠6， KH2PO45,Mg2SO4.7H2O0.8， CaCl2.2H20 2， FeS04'7H20 2， ZnCl20.5， MnCl2.4H20 12, CuS04.5H20 0.05，烟酸0.08，硫胺素0.00015，吡卩多醇0.04， 生物素0.004，核黄素O.Ol， pH5.5。
烟酸80mg，硫胺素0.15mg,吡哆醇40 mg，生物素4 mg，核黄素10mg， 自来水定容至1L。
在该发酵条件下，r g/Wrato CCTCC M202019胞内NADH浓度为7.5 mg/g 菌体干重(DCW)，丙酮酸产量为49.6g/L。 实施例1
在发酵培养基中添加适量(100 120 pmol/L)铁氰化钾使发酵培养基的初始 氧化还原电位达到400 mV，用氧化还原复合电极(法国梅特勒公司产品，型号 Pt4085-DXK)测定发酵培养基中的氧化还原电位，其余条件同对照实施例。
在该发酵条件下，r g/a6rato CCTCC M202019胞内NADH浓度为4.1mg/g DCW,丙酮酸产量为61.9g/L。
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权利要求
1、一种调控培养体系氧化还原电位提高丙酮酸产量的方法，其特征是在光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019发酵培养基中，控制发酵培养基的溶氧浓度为20％，并在发酵培养基中添加外源电子受体铁氰化钾，提高培养基的初始氧化还原电位至400mV，从而降低光滑球拟酵母CCTCC M202019胞内NADH水平，加速糖酵解，提高丙酮酸产量。
专利摘要
一种调控培养体系氧化还原电位提高丙酮酸产量的方法，属于辅因子代谢调控策略优化发酵过程技术领域：
。本发明通过在光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019发酵培养基中，控制发酵培养基的溶氧浓度为20％，并在发酵培养基中添加外源电子受体铁氰化钾，提高培养基的初始氧化还原电位至400mV，从而降低光滑球拟酵母CCTCC M202019胞内NADH水平，加速糖酵解，提高丙酮酸产量。在此发酵条件下，CCTCC M202019胞内NADH浓度降低45.3％，丙酮酸产量由49.6g/L提高到61.9g/L。此策略对其它发酵产品的生产也有指导意义。
文档编号C12P7/40GKCN101624608SQ200910184724
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月20日
发明者刘立明, 周景文, 义 秦, 坚 陈 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan