一种改进的卷烟烟气冷凝物Ames试验的制作方法

专利名称：:一种改进的卷烟烟气冷凝物Ames试验的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种巻烟烟气致突变性试验，特别是一种改进的巻烟烟气冷凝物Ames试验方法。
背景技术：
：化学污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上己发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。B.N.Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验(亦称Ames试验)已被世界各国广为采用。该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。Ames试验是从原核水平检测基因突变最常用的方法，它是一种快速获得化学物质致突变性以及潜在致癌性资料的有效手段，其原理是鼠伤寒沙门氏菌突变株(组氨酸缺陷型)在缺乏组氨酸的培养基上不能生长，当受试物使之能生长时，说明其所携带的突变已被纠正或补偿，即发生了回复为野生型的突变。故可根据在无组氨酸的培养基上菌落生成数量来检测受试物是否为致突变物。其具体方法分为斑点法和平板渗入法，斑点试验只局限于能在琼脂上扩散的化学物质，大多数多环芳烃和难溶于水的化学物质均不适宜用此法。此法敏感性较差，主要是一种定性试验，适用于快速筛选大量受试化合物。平板掺入试验可定量测试样品致突变性的强弱。此法较斑点试验敏感，获阳性结果所需的剂量较低。Ames试验平板渗入法的具体方法是将一定量受试物稀释不同浓度梯度，将O.lmL受试物与O.lml测试菌液(TA97，TA98，TA100，TA102)混匀加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加O.5mL10%S9(大鼠肝微粒体酶)混合液，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照，每种剂量做3个平行。试样通常设4个5个剂量。平皿倒置于37"C温箱培养48h，同一剂量各平皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比(MR)。MR值》2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性传统的试验方法选用TA97,TA98，TA100，TA102四种菌株进行试验，并且活化系统选用10%S9混合液，而实验表明，TA98和TA100两种菌株对巻烟烟气敏感，并且10%和5%S9混合液活化系统表现的结果基本一致。本案申请人曾申请的《巻烟烟气致突变性的毒理学测定评价方法》专利，其公开号CN101255456，其步骤为(l)实验菌株为TA98、TA100;(2)制备巻烟烟气凝集物CSC;(3)制备培养基、缓冲液及所用试剂；(4)接种细菌于96孔板、染毒、培养；(5)观察结果与判断。由于巻烟烟气冷凝物是一复杂化学物体系，某些化合物需要预先与细菌培养才能充分发挥作用，与本发明相比，CN101255456《巻烟烟气致突变性的毒理学测定评价方法》忽略了这一因素。
发明内容本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的问题而专门研究的一种改进的巻烟烟气冷凝物Ames试验方法，该方法可提高试验的敏感性，更适用于复杂的巻烟烟气基因突变的检测。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明改进的巻烟烟气冷凝物Ames试验包括以下试验步骤1.平板及细菌的准备将1.5%琼脂培养基高压灭菌后，加入磷酸盐储备液和40%葡萄糖溶液，充分摇匀后倒入90mm平皿，每个化学物剂量用三个平板进行平行，制备足够的平板后，放入生化培养箱，37'C培养过夜以除去水分及检査有无污染；随后进行增菌工作，取2个灭菌角烧瓶，加入营养肉汤10mL,刮取少量TA98、TA100菌种，接种至肉汤中；37'C振荡培养10h，使细菌达到1-2Xl(f个/mL;2.顶层琼脂及受试物配制将琼脂溶液高压后加入0.5咖oL/L组氨酸-生物素溶液，然后以2mL分装于试管，并在45'C水浴中保温；然后配置受试物一巻烟烟气冷凝物及阳性对照，阳性对照分别是，无活化系统时TA98阳性对照为40ug/raL硝基芴，TA100阳性对照为10ug/mL;有活化系统时TA98、TA100阳性对照为20ug/mL蒽胺；阴性对照为溶剂对照；3.受试物预培养及平板渗入吸取O.lmL受试物与O.lmL菌液混匀，在37'C条件下，预培养30min;需活化的另加入0.5mL5y。S9混合液；之后，取已融化并在45t:水浴中保温的顶层培养基一管(2mL)，加入0.2mL受试物菌液混合液，活化的加入0.7mL受试物、菌液及S9混合液，迅速混匀，倒入底层平板培养基上，转动平板使顶层培养基均匀分布在底层上，平方固化，37'C培养48h:4.计数菌落及数据统计计数各平板菌落数，并进行结果统计，进而评价烟气冷凝物的致突变性。本发明的特点在于实验对象选用对巻烟烟气敏感的TA98和TA100两种菌株作为试验用菌株，活化系统选用5%S9混合液(由于10%和5%S9活化系统表现的结果基本一致)D且由于巻烟烟气含多种物质，有别于纯物质的试验方法，本发明增加了巻烟烟气冷凝物与细菌预培养的步骤，提高了某些化合物的敏感性，试验数据更为准确，更适用于复杂的巻烟烟气基因突变的检测。具体实施方式本发明以下结合实例作进一步描述对某一国产烤烟型品牌巻烟进行Ames试验。首先制备平板，将1.5%琼脂培养基高压灭菌后，加入磷酸盐储备液和40%葡萄糖溶液，充分摇匀后倒入90mm平皿，37'C培养过夜以除去水分及检査有无污染；随后进行增菌工作，取2个灭菌角烧瓶，加入营养肉汤10mL，刮取少量TA98、TA100菌种，接种至肉汤中。37t:振荡培养10h，使细菌达到1-2X109个/mL。制备顶层琼脂，将琼脂溶液高压后加入0.5咖oL/L组氨酸-生物素溶液，然后以2mL分装于试管，并在45'C水浴中保温；然后配制受试物(巻烟烟气冷凝物)及阳性对照。巻烟烟气冷凝物的浓度分别为25、50、100、125、250、500ixg/mL;阳性对照分别是，无活化系统时TA98阳性对照为40ug/mL硝基芴，TAIOO阳性对照为10ixg/mL;有活化系统时TA98、TAIOO阳性对照为20ixg/mL蒽胺。阴性对照为溶剂对照。然后，吸取0.lmL受试物与0.lmL菌液混匀，在37'C条件下，预培养30min;需活化的另加入0.5mL5y。S9混合液。之后，取己融化并在45。C水浴中保温的顶层培养基一管(2mL)，加入0.2mL受试物菌液混合液，活化的加入0.7mL受试物、菌液及S9混合液，迅速混匀，倒入底层平板培养基上，转动平板使顶层培养基均匀分布在底层上，平方固化，37t:培养48h;计数各平板回突变菌落数。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1、一种改进的卷烟烟气冷凝物Ames试验，其特征在于包括以下试验步骤1).平板及细菌的准备将1.5％琼脂培养基高压灭菌后，加入磷酸盐储备液和40％葡萄糖溶液，充分摇匀后倒入90mm平皿，每个化学物剂量用三个平板进行平行，制备足够的平板后，放入生化培养箱，37℃培养过夜以除去水分及检查有无污染；随后进行增菌工作，取2个灭菌角烧瓶，加入营养肉汤10mL，刮取少量TA98、TA100菌种，接种至肉汤中；37℃振荡培养10h，使细菌达到1-2×109个/mL；2).顶层琼脂及受试物配制将琼脂溶液高压后加入0.5mmoL/L组氨酸-生物素溶液，然后以2mL分装于试管，并在45℃水浴中保温；然后配置受试物-卷烟烟气冷凝物及阳性对照，阳性对照分别是，无活化系统时TA98阳性对照为40μg/mL硝基芴，TA100阳性对照为10μg/mL；有活化系统时TA98、TA100阳性对照为20μg/mL蒽胺；阴性对照为溶剂对照；3).受试物预培养及平板渗入吸取0.1mL受试物与0.1mL菌液混匀，在37℃条件下，预培养30min；需活化的另加入0.5mL5％S9混合液；之后，取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2mL)，加入0.2mL受试物菌液混合液，活化的加入0.7mL受试物、菌液及S9混合液，迅速混匀，倒入底层平板培养基上，转动平板使顶层培养基均匀分布在底层上，平方固化，37℃培养48h；4).计数菌落及数据统计计数各平板菌落数，并进行结果统计，进而评价烟气冷凝物的致突变性。专利摘要一种改进的卷烟烟气冷凝物Ames试验，其特征在于包括以下试验步骤1.平板及细菌的准备，2.顶层琼脂及受试物配制，3.受试物预培养及平板渗入，4.计数菌落及数据统计。本发明的特点在于实验对象选用对卷烟烟气敏感的TA98和TA100两种菌株作为试验用菌株，活化系统选用5％S9混合液。且由于卷烟烟气含多种物质，有别于纯物质的试验方法，本发明增加了卷烟烟气冷凝物与细菌预培养的步骤，提高了某些化合物的敏感性，试验数据更为准确，更适用于复杂的卷烟烟气基因突变的检测。文档编号C12Q1/68GKCN101671735SQ200910172253公开日2010年3月17日申请日期2009年9月24日发明者刘惠民,孙学辉,尚平平,斌彭,翔李,聪聂,谢剑平申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan