专利名称:一株醋酸钙不动杆菌及其培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株可降解石油的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) WG-6及其培养方法与应用，属于微生物技术领域：
。
背景技术：
我国作为石油生产、消费大国，由于生产条件、环保技术等方面相对落后，石油污染问题相当突出。石油类污染物进入土壤后，由于其特殊的物理和化学性质，导致其残留时间长且难以去除，对土壤环境造成一系列的危害，给污染地区的生态系统、地下水源以及人类健康带来严重的负面影响。
土壤中石油污染的处理方法按其性质可分为3种物理方法，化学方法和生物方法。其中物理和化学方法存在如下缺陷消极处理、费用昂贵和二次污染严重。生物方法修复石油污染土壤是指利用特定的生物将土壤中的石油及石油产品转化成为无害的无机化合物
(通常为水和二氧化碳)的过程。由于其费用低、效果好、无二次污染等优点，迅速成为土壤石油污染处理研究的热点。
随着修复技术研究的深入，各种污染土壤的修复装置和微生物菌剂的制作技术被相继报道。中国专利文件公告号CN ^23365Y(申请号03214009. 6)公开了一种污染土壤生物修复设施，中国专利文件公开号CN 101234392Α(申请号200810014714. 2)公开了一种高浓度石油污染土壤的生物修复装置和方法，这些修复方法都属于异位修复方法，适用于污染严重的土壤，投资成本高，对于污染程度轻微、面积大的土壤不适合。中国专利文件公开号CN 1785539Α(申请号200510130674. 4)公开了一种石油污染土壤的原位生物修复方法，该方法是添加真菌-细菌液态混合微生物制剂，添加土壤结构改良剂、有机肥和无机营养盐，采用灌溉、翻耕、覆盖多孔地膜和保水保温的工程设施完成石油污染土壤的原位修复过程。中国专利文件公开号CN 1990854Α(申请号200510130900. 9)公开了一种处理稠油污水的微生物菌剂及制备方法，该菌剂包含了铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、弗氏丙酸杆菌、液化金杆菌、环状芽孢杆菌、短小杆菌、球形节杆菌、木棍杆菌、热土厌氧棒菌，由不同菌株的协同作用，可以加快稠油污水的生物处理。这些微生物菌剂的生产大多是通过微生物液态发酵培养后直接使用或是与固态微生物载体吸附后使用，菌剂中的石油降解菌仅仅来自液态发酵液，活菌数目有限，并且菌体本身降解石油速度较慢，菌剂生产成本较高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一株可降解石油的醋酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus) WG-6。
发明概述
本发明所述醋酸钙不动杆菌能够直接将石油污染物分解并作为营养物质加以利用，同时进行生长繁殖，石油降解效果明显；本发明还提供由该醋酸钙不动杆菌及其他成分混合制备的高密度菌剂，该菌剂不仅能快速分解石油，而且菌剂中含有的其他物质能够改善土壤的微生态环境，加快土壤的修复进程。
术语解释
CFU/mL 指的是每毫升样品中含有的微生物群落总数。
CFU/g 指的是每克样品中含有的微生物群落总数。
发明详述
醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus) WG-6，该菌株 2010 年 6 月 11 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号=CGMCC No. 3915。
上述醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)WG-6分离自我国胜利油田的石油污染土壤，菌种保藏号为CGMCC No. 3915，微生物株名为WG-6，不动杆菌属，革兰氏阴性菌，粗短，静止时近乎球状，无芽胞及鞭毛，无荚膜，专性需氧，氧化酶试验阴性，接触酶阳性。WG-6的16s rDNA测序结果如SEQ ID NO. 1所示。
上述醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) WG-6的培养方法，步骤如下
(1)取菌种保藏号为CGMCC No. 3915的醋酸钙不动杆菌(AcinetcAacter CalCOaceticuS)WG-6接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，活化16 32h，然后，转接到液体 LB培养基或液体牛肉膏蛋白胨培养基内，摇瓶活化16 32h，得活化后菌液；
(2)将步骤(1)制得的活化后菌液按体积比2% 10%的比例转接到液态发酵培养基中，摇床培养16 32h，转速为150 250rpm，培养温度为20 30°C，得醋酸钙不动杆菌菌液。
优选的，所述步骤( 醋酸钙不动杆菌菌液中醋酸钙不动杆菌的有效活菌数为 IO7 109CFU/mL。
优选的，所述步骤O)中每IOOmL液态发酵培养基含有如下成分葡萄糖1 3g,豆粕粉为 1 2g，酵母粉为 0. 5 lg, K2HPO4 0. 1 0. 12g，CaCl2 0. 005 0. 015g， MgSO4 · 7Η200· 12 0. 18g, MnSO4 0. 005 0. 015g。
步骤(1)中的牛肉膏蛋白胨斜面培养基、液体LB培养基和液体牛肉膏蛋白胨培养基均为本领域常用培养基，可采用现有技术配制。也可按如下配制
牛肉膏蛋白胨斜面培养基牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂1. 5g/L，pH 调至7. 2。
液体LB培养基蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH调至7. 0。
液体牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，pH 7. 4 7. 6。
上述醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)WG-6在石油降解方面的应用。
由上述醋酸钙不动杆菌(AcinetcAacter calcoaceticus)WG-6制备的高密度菌剂，由如下步骤制得
(i)取醋酸钙不动杆菌菌液，按重量比5% 10%的比例接种于固态发酵培养基中，混合均勻，调整含水量为30wt% 60wt%，20 30°C温度下培养2 4天，得固态醋酸钙不动杆菌；
(ii)将步骤(i)制得的固态醋酸钙不动杆菌，室温风干至含水量为10wt% 15wt%，即得高密度菌剂；
所述的固态发酵培养基由麸皮与草炭按重量比0. 5 2 1的比例混合制得。
所述的高密度菌剂中醋酸钙不动杆菌的有效活菌数为IO9 10"CFU/g。
上述高密度菌剂在修复石油污染土壤中的应用，步骤如下
(1)向含原油1 5wt%的土壤中添加氮磷农用复合肥，调节土壤含量中碳、氮、磷的摩尔比为(100 120) (5 10) 1，加水调节土壤含水量至20 40wt%，疏松土壤， 得含油培养土壤；
(2)按质量比1 5%向步骤(1)制得的含油培养土壤中加入高密度菌剂，混合均勻，每隔一周翻土一次，维持土壤含水量20 50wt%，修复一个月即可。
所述的氮磷农用复合肥为硝基磷酸铵；其中，硝基磷酸铵含N 26wt%, P 5. 67wt%。
本发明具有如下优点
本发明所述的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) WG-6，是从石油污染现场筛选的石油高效降解菌，具有培养简单、降解石油迅速的特点。本发明所述的高密度菌剂具有活菌数高，菌剂中的菌种适应性强；采用液态、固态两步发酵培养的方法活菌数目能提高10倍以上，降低液态发酵的压力和能耗；所选用的固态发酵原料麸皮和草炭能显著增加土壤的有机质含量，激活土壤中的多种微生物活性，改善土壤的微生态环境；添加的复合肥料能够刺激微生物生长，加快对石油污染物的降解，也能刺激土壤中的其他微生物、 植物的生长，加速土壤修复的进程。本发明所述固体菌剂制备过程简单易操作，成本低廉， 在石油污染土壤的生物修复领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述，但本发明所保护范围不仅限于此。
实施例中所述醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)WG-6，该菌株 2010年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No.3915。
实施例中所述草炭购自光合园林集团，麸皮购自济南市历城区董家面粉厂，原油来自胜利油田孤东油区脱水原油，实施例中所用其他试剂均为市售普通产品。
实施例1 醋酸钙不动杆菌对石油的降解
挑取醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)WG_6接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，活化16h。
所述牛肉膏蛋白胨斜面培养基组分如下牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，琼脂 1. 5g，蒸馏水 lOOOmL，pH7. 2。
从牛肉膏蛋白胨斜面培养基上挑取醋酸钙不动杆菌接到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，在转速为250rpm的摇床上培养Mh，再按照体积比5%的接种量接种到原油培养基中，置于摇床上培养7d，转速为150rpm。以不接菌的原油培养基为空白对照。培养结束时，向培养基中加入三氯甲烷，进行萃取，将萃取液加热至75°C，使三氯甲烷挥发干净，采用重量法测定培养基中残油含量。
所述原油培养基成分如下
NH4NO3 2. 0g, K2HPO4 1. 5g, KH2PO4 3. 0g, MgSO4 · 7H20 0. Ig,无水 CaCl2 0. Olg, Na2EDTA2 · H2O 0. Olg，原油 1. Og, ρΗ7· 5，H2O IOOOmL0
采用下面公式计算石油烃的生物降解率(η % ):
n (% ) = (ω0-ωχ)/ω0Χ100
式中Oci为对照培养基中残油含量；ωχ为测试菌培养基中残油含量。
在液体摇瓶中醋酸钙不动杆菌对原油具有很强的降解能力，一周的石油降解率为 27. 5%。
实施例2 可修复石油污染土壤的高密度菌剂的制备
11011 ^ ]^ (Acinetobacter calcoaceticus)WG-6
(1)取菌种保藏号为CGMCC No. 3915的醋酸钙不动杆菌(AcinetcAacter CalCOaCetiCUS)WG-6接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基(组分同实施例1)上，培养温度为 280C，活化Mh，然后，转接到液体牛肉膏蛋白胨培养基内，培养温度为20°C，摇瓶活化16h， 得活化后菌液；
(2)将步骤(1)制得的活化后菌液按体积比5%的比例转接到液态发酵培养基中， 摇床培养16h，转速为200rpm，培养温度为20°C，得醋酸钙不动杆菌菌液。经检测，醋酸钙不动杆菌菌液中醋酸钙不动杆菌的有效活菌数为7. 5X 107CFU/mL。
上述步骤(2)中每IOOmL液态发酵培养基含有如下成分葡萄糖lg，豆粕粉为lg， 酵母粉为 0. 5g, K2HPO4 0. lg, CaCl2 0. 005g, MgSO4 · 7H20 0. 12g, MnSO4 0. 005g。
由上述醋酸钙不动杆菌菌液制备高密度菌剂，步骤如下
(i)取醋酸钙不动杆菌菌液，按重量比5%的比例接种于固态发酵培养基中，混合均勻，调整湿度为30%，20°C温度下培养2天，得固态醋酸钙不动杆菌；
(ii)将步骤(i)制得的固态醋酸钙不动杆菌，室温风干至含水率为15wt%，即得高密度菌剂；经检测，高密度菌剂中醋酸钙不动杆菌的有效活菌数约为8. OX 109CFU/g。
所述的固态发酵培养基由麸皮与草炭按重量比0.5 1的比例混合经高温灭菌制得。
实施例3 可修复石油污染土壤的高密度菌剂的制备
如实施例2所述，不同之处在于，
步骤(2)中每IOOmL液态发酵培养基含有如下成分葡萄糖3g，豆粕粉为2g，酵母粉为 lg, K2HPO4 0. 12g, CaCl2 0. 015g, MgSO4 · 7H20 0. 18g, MnSO4 0. 015g。
步骤O)中活化后菌液按体积比10%的比例转接到液态发酵培养基中，接种后置于摇床上培养32h，温度为30°C，摇床转速为250rpm，醋酸钙不动杆菌的有效活菌数分别约为 2. 0X109CFU/mL ；
步骤⑴中所述的固态发酵培养基由麸皮与草炭按重量比0. 5 1的比例混合经高温灭菌制得；固态发酵培养基湿度为60wt%，醋酸钙不动杆菌菌液接种量为10%，培养时间为4天，高密度菌剂中醋酸钙不动杆菌的有效活菌数分别约为1. 2X 101(lCFU/g。
实施例4 可修复石油污染土壤的高密度菌剂的制备
如实施例2所述，不同之处在于，[0065]步骤( 中每IOOmL液态发酵培养基含有如下成分葡萄糖1. 5g，豆粕粉为1. 5g， 酵母粉为 0. 8g, K2HPO4 0. llg, CaCl2 0. Olg, MgSO4 · 7H20 0. 15g, MnSO4 0. Olg。
步骤O)中活化后菌液按体积比7%的比例转接到液态发酵培养基中，接种后置于摇床上培养30h，温度为^°C，摇床转速为200rpm，醋酸钙不动杆菌的有效活菌数分别约为 4. 5X108CFU/mL ；
步骤(i)中所述的固态发酵培养基由麸皮与草炭按重量比1 1的比例混合经高温灭菌制得；固态发酵培养基含水量为45wt%，醋酸钙不动杆菌菌液接种量为8%，培养时间为3天，高密度菌剂中醋酸钙不动杆菌的有效活菌数分别约为2. 2X 101(lCFU/g。
实验例5 高密度菌剂应用效果试验
采用实施例2制备的高密度菌剂进行盆土试验。石油污染的土壤制备方法如下 从农田中采集土样，按重量比5%加入新鲜石油，自然风干，粉碎，混勻。
将上述石油污染的土壤分别制备三组土样做对照实验
一组土样称取石油污染的土壤1. 0kg，加入菌剂50g，硝基磷酸铵22. 4g ；
二组土样称取石油污染的土壤1. 0kg，加入菌剂50g ；
三组土样称取石油污染的土壤1. Okgo
实验步骤如下
将上述三组土样，分别装入花盆，调节土壤含水量至20 50wt%，疏松土壤，室温放置一个月。
采用常规的重量法测定石油含量，计算公式为
石油总烃(g/kg)=蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1-含水率％ )*1000。
经过一个月的修复，一组土样的石油降解率为35.7%，二组土样的石油降解率为 22. 5%，三组土样的石油降解率为7. 3%。
由此可以看出，硝基磷酸铵能较大的提高菌剂的石油降解能力。
实验例6 高密度菌剂应用效果试验
采用实施例2制备的高密度菌剂修复胜利油田孤东油区含盐2. 0 5. 0%、含油 1.65%的盐碱土壤。
取土 对胜利油田孤东油区进行模拟原位修复，挖2个边长为an深0. 5m的土坑， 编为1#坑和2#坑，由两坑中共取含油土壤4m3，充分搅拌均勻，然后平均分成2份。
回填将第1份含油土壤填入1#坑做为空白对照；第2份含油土壤加入50kg的固体菌剂和土壤重量0. 74%的硝基磷酸铵并搅拌均勻，然后填入2#坑内。
修复保持1#坑和2#坑中土壤含水量20 50wt%，每隔一周翻动土壤一次，并进行通风强化，定期取样测定总石油烃含量，修复一个月。
采用常规的重量法测定石油含量，计算公式为
石油量(g/kg)=蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1-含水率％ )*1000。
经过一个月的修复后，1#坑的石油降解率2. 7%，2#坑的石油降解率达到36. 2%， 即添加固体微生物菌剂的修复效果良好。
权利要求
1.一株醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) WG-6，该菌株 2010 年 6 月 11 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 3915。
2.一种权利要求
1所述醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) WG-6的培养方法，步骤如下(1)取菌种保藏号为CGMCCNo. 3915的醋酸钙不动杆菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，活化16 32h，然后，转接到液体LB培养基或液体牛肉膏蛋白胨培养基内，摇瓶活化 16 32h，得活化后菌液；(2)将步骤(1)制得的活化后菌液按体积比2% 10%的比例转接到液态发酵培养基中，摇床培养16 32h，转速为150 250rpm，培养温度为20 30°C，得醋酸钙不动杆菌菌液。
3.如权利要求
2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤( 醋酸钙不动杆菌菌液中醋酸钙不动杆菌的有效活菌数为IO7 109CFU/mL。
4.如权利要求
2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤O)中每IOOmL液态发酵培养基含有如下成分葡萄糖1 3g，豆粕粉为1 2g，酵母粉为0. 5 lg，K2HPO4 0. 1 0. 12g, CaCl2 0. 005 0. 015g, MgSO4 · 7H20 0. 12 0. 18g, MnSO4 0. 005 0. 015g。
5.权利要求
1所述醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)WG-6在石油降解方面的应用。
6.权利要求
1所述醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)WG-6制备的高密度菌剂，由如下步骤制得(i)取醋酸钙不动杆菌菌液，按重量比5% 10%的比例接种于固态发酵培养基中，混合均勻，调整含水量为30wt% 60wt%，20 30°C温度下培养2 4天，得固态醋酸钙不动杆菌；(ii)将步骤(i)制得的固态醋酸钙不动杆菌，室温风干至含水量为10wt% 15wt%， 即得高密度菌剂。
7.如权利要求
6所述的高密度菌剂，其特征在于，所述的固态发酵培养基由麸皮与草炭按重量比0. 5 2 1的比例混合制得。
8.如权利要求
6所述的高密度菌剂，其特征在于，所述的高密度菌剂中醋酸钙不动杆菌的有效活菌数为IO9 10"CFU/g。
9.权利要求
6所述高密度菌剂在修复石油污染土壤中的应用，步骤如下(1)向含原油1 5wt%的土壤中添加氮磷农用复合肥，调节土壤含量中碳、氮、磷的摩尔比为(100 120) (5 10) 1，加水调节土壤含水量至20 40wt%，疏松土壤，得含油培养土壤；(2)按质量比1 5%向步骤(1)制得的含油培养土壤中加入高密度菌剂，混合均勻， 每隔一周翻土一次，维持土壤含水量20 50wt%，修复一个月即可。
10.如权利要求
9所述的应用，其特征在于，所述的氮磷农用复合肥为硝基磷酸铵。
专利摘要
本发明涉及一株可降解石油的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)WG-6及其培养方法与应用，属于微生物技术领域：
。该菌株2010年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.3915。醋酸钙不动杆菌能够直接将石油污染物分解并作为营养物质加以利用并进行生长繁殖，石油降解效果明显；本发明还提供由该醋酸钙不动杆菌及其他成分混合制备的高密度菌剂，该菌剂不仅能快速分解石油，而且菌剂中含有的其他物质能够改善土壤的微生态环境，加快土壤的修复进程。
文档编号C12R1/01GKCN101914470 B发布类型授权 专利申请号CN 201010233473
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月22日
发明者刘娜, 孔学, 张强, 李艳, 桂召龙, 王加宁, 王田丽, 祝威, 胥九兵, 董健, 陈贯虹, 高永超 申请人:山东省科学院生物研究所, 胜利油田胜利勘察设计研究院有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan