利用负股核糖核酸引起植物体细胞的变化的制作方法

专利名称:利用负股核糖核酸引起植物体细胞的变化的制作方法
本发明涉及把重组DNA技术应用于高等植物的遗传转化或基因工程。特别是，涉及通过采用负RNA股引起高等植物体细胞的变化，以便控制植物的基因表达或者获得其他有用的体细胞效应，例如抗病性的方法。
目前人们已经能够在体外组建遗传物质，即DNA的片段，并将这些片段转化到细菌中的质粒中。同时也能够利用克隆了的片段，或在细菌质粒中克隆完整基因，而质粒作为载体可把这些片段或者基因携入其他细胞。已经获得合适的载体可用于遗传上转化各个植物细胞，从这些细胞可以再生出完整未损的植物。有文件表明外源的基因可以稳定地插入植物细胞的基因组内，从而使完整未损，体细胞正常并且具有繁殖能力的植物得以重建。K.A.Barton.等。含有基因工程方法获得的T-DNA的全长考贝的完整烟草植物的更新，以便将T-DNA传递到R1子代，32细胞1033(1983年4日)。研宄者们报导他们已经能够将完全的外源基因引入植物细胞并在这些植物细胞中获得基因的表达，同时知道并且期望这些细胞能够被再生为完整未损的植物中。欧洲专利申请S.N.84302582.2号，1984年4月16日申请(Kemp);PCT申请号WO84/02920/和W084/02913，两者都于1984年1月16日申请(Fraley)。一般地说，插入的基因只有构成位于植物系统的合适的基因控制区域时才能在植物中起作用。
目前绝大多数的用于改变植物的基因工程的方法都包括在细胞水平上利用天然植物转化因素Agrobacterium tumefaciens，对植物细胞进行饰变的过程，而该转化因素具有感染双子叶植物，并将A.tumefaciens的某一部分DNA(称为T-DNA)转移到植物细胞中去的天然能力。已经提出其他的方法，不采用A.tumefaciens，同时用于转化双子叶植物及单子叶植物的个别细胞，尤其是原生质体。目前许多植物种的基因工程技术上的主要障碍是，不能顺利地从愈伤组织培养物或者原主质再生成许多植物种。对于用目前的技术可以再生的那些植物种而言，培养细胞的基因转化的可导致在完整未损或其他正常植物中完全外源基因的表达。对于用目前技术还不能使之再生的植物种而言，一旦这些技术被改进后，便可实现对于这些完整植物种的有规则的遗传转化。
一旦能够用基因工程方法创造一种植物种，接下来的问题便是使植物获得什么样的合理的遗传转化以便使植物按照人们意愿变得更加适于农业或园林应用。应用于植物的基因工程的一个共同的方法是把外源性的蛋白基因导入植物，以使该基因在植物中表达蛋白质，该蛋白可以有一种或者多种的用途，例如抗病性，抗昆虫性，酶促活性，或可用作食物配料等等。
在此叙述的发明提供一种基因工程技术在植物方面的应用的替代方法，以便使植物获得体细胞的有益的变化，该方法不涉及任何外源蛋白表达，取而代之，该方法涉及对于内源蛋白表达的控制或者对于某一蛋白基因或其他DNA或RNA因子的操纵，该DNA或RNA因子是通过外界因素，如疾病因素或感染因素自然导入植物细胞的。
以前已经认识到人工组建的负股RNA将在体内与互补的RNA杂交。这一现象已用于研宄在大肠杆菌中基因表达的有规律的机制。Mizuno等，在大肠杆菌K-12中小的RNA转录本(micRNA)对基因表达的调节作用，10 Proc.Japan Acad.59.Ser.B，pp.335-338(1983)，Mizuno等，调节基因表达的独特机制由互补RNA转录本(micRNA)引起的转录抑制作用，81 Proc.Natl，Acad.Sci.USA，pp.1966-1970(1984)。
本发明涉及到对植物进行有用的遗传转化的方法，该方法使植物本身获得有用的体细胞变化，而不特别涉及外源蛋白的表达。该方法包括把为负股RNA的转录而构成的DNA顺序导入植物基因组，这种负股RNA基本上是内源的或天然引入的RNA股的目标的互补，其功能需要加以抑制以便防止内源蛋白基因的表达或者防止自然导入的RNA或DNA的作用，如通过某些类型寄生虫或疾病感染所发生的那样。
本发明的一个目的是提供一种用基因工程创造不需要引起外源蛋白的表达而具有有用的体细胞特性的植物的方法。
本发明的另一个目的是提供一种总的控制植物中的内源基因表达的方法。
本发明的其他目的及优点由下面的详细说明来表明。
附图简要说明图1表示用于作为本发明例子之一的起始材料的质粒POM5 H2的限制内切酶图。
图2为烟草花叶病毒的RNA的图解。
图3为表示由下面的例1详述的质粒的处理过程的图解。
图4为表示由下面的例1详述的另一个对质粒的处理过程的图解。
图5为表明例2详述的对质粒的处理过程的图解。
概要地说，本发明描述了通过采用将DNA顺序插入植物基因组以引起特定的负RNA股的转录而使高等植物发生体细胞变化的总的方法，其中负RNA股将与选择的靶RNA股杂交以选择性地抑制RNA顺序的转录、逆转录或者靶RNA顺序的操纵或功能的发挥，从而最终引起高等植物体细胞有用的变化。如果靶RNA股是植物细胞中正常表达基因的mRNA转录本，那么负RNA股与靶RNA的杂交作用可被直接用于控制(即抑制)内源基因的表达。本发明也可用于抑制某些发病过程，如RNA病毒顺序的逆转录翻译，或复制。本发明提供的负股RNA已证明可用作调节子基因与RNA链杂交，否则这些RNA股将在RNA处理中与启动区或抑制基因作用，或者与其他的调节子作用以控制基因的表达。
在体内正常的核条件下，DNA是双股的，并且DNA的转录产生RNA是不对称的。不对称性是指转录起动位于DNA编码顺序的一端，因此有一股，并且只有一股DNA链被转录。据推测，这样正常转录所产生的RNA对有机体有用的，而被称为正股RNA。与正股RNA的碱基对互补的RNA顺序被称为负股RNA。负股RNA可以通过对被正常转录的DNA股相对的那条DNA股进行转录而获得。由于启动区转录起始是不对称的，在自然情况下是不会发生相对的DNA股的转录。因此负股RNA的创造包括了在双股DNA顺序上以相反或逆方向创造一个具有转录调节信号的嵌合基因。
负股RNA一词在此处是指被专门组建的DNA顺序编码的一条特定的RNA股，它对预先选定的靶RNA具有重要的互补性。负RNA股的互补部分须足够的长，以便能在正常的细胞质条件下与所选靶RNA顺序发生顺序识别。顺序识别通常是以正负股RNA的杂交从而去除正股RNA活性的形式发生，但也可能包括其他的RNA与RNA的互相作用，这种相互作用起着干扰正股RNA活性的作用。
由于这里所用的负RNADNA顺序是特别组建的嵌合DNA顺序，适合于植物转录载体使植物转化引起植物转录一条预先的负RNA股。负RNADNA顺序需要一个启动区以启动负RNA顺序的转录。尽管转录是发生在与通常相对的DNA股上，转录本身是正常的。负RNADNA顺序可以包括也可以不可括多聚腺苷酸化成核糖体结合顺序。如果逆向RNA顺序是植物细胞的细胞溶质的组成，那么多聚腺苷酸化或一些其他型式的3′末端处理或者终端信号可能是合适的。
本发明所用的靶RNA是指一段内源性的或者天然产生的RNA顺序mRNA顺序从典型上讲是在植物基因组所含有的内源基因或组建的基因的表达过程所建造的mRNA顺序。其他内源性RNA顺序包括snRNA、scRNA、rRNAt RNA等等。在此所用术语天然产生的靶RNA顺序是指通过天然生物过程(如，寄生或疾病)导入植物细胞的RNA顺序。这方面的例子包括病毒RNA及由细菌原DNA产生的RNA。
在此详述的本发明的实施例是专门涉及到植物及适用于双子叶植物中表达的载体。烟草之所以被选为这些例子中的代表系统，主要是因为目前能够采用作为现有技术方式之一的，从转化个别细胞来再生植物的方法来再生烟草植物。用于这里的表达载体，对于许多双子叶植物无论是在组织培养物或是整株植物中均可使用。因而在此公开的发明适用于能够由转化的植物愈伤组织再生的双子叶植物，通过转化个体细胞获得完整未损的双子叶植物。对于那些目前还不能再生的植物种类，只要当再生技术有了进步，也完全可以应用本发明。此外，文献中记载，实际操作表明嵌合表达载体，适用于某些单子叶植物细胞，尤其是玉米及谷类，至少适用于它们的组织培养物。因而我们完全有理由预期，当这些植物的再生技术得以解决后，这些载体也同样地适用于整株单子叶植物。因而本发明适用于双子叶植物，也适用于单子叶植物。本发明的目的是利用负RNA股的活性使再生的整株植物及其子代发生体细胞的变化。这种体细胞变化可以是形态学方面的，例如当一个内源性基因的表达被抑制时表现出来的，体细胞的变化也可以仅当植物受到例如疾病、干旱或其他不利情况的挑战时才表现出来。
参阅以下的例子可以更好地理解本发明，这些实例旨在举例，并不限于这些例子。
例1抗病性烟草花叶病毒RNA本例针对由烟草花叶病毒侵入而引起的细胞的疾病过程的抑制作用。烟草花叶病毒(TMV)是一种植物正股RNA病毒，其RNA在感染细胞的发病过程的某阶段被翻译及复制。TMW的正股RNA被注射至受感染的植物细胞的细胞溶质内。然后，正股RNA上的两个基因被翻译而产生两种蛋白质产物，这两种蛋白产物反过来触发产生TMVRNA的负股补体。互补股作为正链复制的模板，于此同时，两个以上的亚染色体正股RNA被翻译为其他一些蛋白质，外壳蛋白质是其之一。复制的正股RNA被外壳蛋白色裹而形成新的TWV病毒。
本例的方法是转化植物细胞，使之转录负RNA股，并与靶RNA杂交，在此例中，靶细胞即为TMVRNA本身(正股)。通过杂交而有效地中和靶TMVRNA，因而该靶TMVRNA不会被TMV宿主复制或者翻译。通过这样的方式，增强植物对烟草花叶病毒感染的抵抗力，并且诱发植物产生相似的各种抵抗力，如抗病毒感染或任何疾病，包括在植物宿主细胞中的病原体核酸的影响。
本发明已描述的质粒，包含有一段从烟草花叶病毒RNA上的一大部分上反向转录的cDNA顺序。该质粒称为POM5 H2(Meshietal，Virolgy，118∶64-65(1982))。图1表示了POM5 H2质粒的限制性内切酶图。图2表示了POM5 H2cDNA顺序与整个TMVRNA的关系。cDNA片段长度大约为二干碱基，从完整病毒顺序的3′末端开始，大约占完整病毒顺序的1/3c.cDNA顺序包括3′非编码区，据报导该区域在其他独特的相似病毒中具有专一的独特的结构特征，而这些特征对于感染细胞中的病毒复制是必不可少的(Ahlquist et al.，Plant Mol.Biol.3∶37-44(1984))，很明显，用限制性核酸内切酶PstⅠ，可以从由质粒组建方法确定的质粒POM5 H2的限制性位点，及从TMV顺序的其他cDNA克隆得到的TMV顺序，水解得到完全的cDNA插入片段，由此，该插入片段被完整地从质粒上切下来。另外，用限制性内切酶HinfⅠ水解质粒可以得到几个片段。HinfⅠ水解片段中的一段被称为HinfⅠB片段(如图1如末)，代表烟草花叶病毒基因组的第5698核苷酸至6365核苷酸的顺序，该顺序含有外壳蛋白质编码区域，11个核苷酸的5′末端的非编码区及位于编码区3′端的非编码的重要顺序的一部分(203碱基对中的174碱基对)。因而可以采用两种可供选择的技术从载体pOM5 H2中得到负RNA股，用于抑制TMV病毒对宿主植物细胞的侵害。技术之一是引起PstⅠ碎片的负转录本的重建，该负转录本是二千碱基的负股，该负股与细胞中的病毒RNA的三分之一相杂交。另一技术采用Hinf ⅠB碎片引起外壳蛋白质编码区的负转录本的重组，并与病毒RNA的外壳蛋白部份或与蛋白合成过程中外壳蛋白的mRNA杂交。下向将对这两种技术进行描述。
外壳蛋白质负RNA股由HinfⅠ水解POM5 H2得到的Hinf ⅠB碎片可以通过电泳HinfⅠ水解物质而分离。碎片再用T4DNA聚合酶处理，以产生一种钝端的碎片。产生的片段通过其上的钝端与预先用Hinc Ⅱ水解的质粒PUC12连接在一起。该钝端连结的产物为一个包含POM5 H2 Hinf ⅠB碎片的，其侧面具有若干独特的限制性位点的质粒PCMC1050。图3概要地说明这一过程。
重组体质粒PCMC1050随后用限制性内切酶PstⅠ及BamHⅠ水解产生两个片段，选择并分离出其中较少的片段，并与PCMC66相连结。质粒PCMC66是一个中间表达载体，含有启动区顺序及取自A.tumefaciens的蓝曙红(nopaline)合酶的聚腺苷酸顺序，该载体可用于植物，插入在启动区的聚腺苷酸顺序邻近位子有一些有用的独特的限制性位点的载体。载体PCMC66预先用PstⅠ及BglⅡ水解。质粒连结后称为PCMC1054，通过连接将TMVHinf ⅠB片段携入，并位于蓝曙红(nopaline)合酶启动区及聚腺苷酸顺序的阅读方向相关的相反定向上。PCMC1054中的Hinf ⅠB片段的定向是受位于片段左端的限制性部点的支配，该限制位点只允许以需要的反向定位与预先水解的PCMC66进行连接。相反地，也就是说，正常的TMV片段的阅读方向与正常的宿主载体的启动区及聚腺苷酸顺序的转录方向的定位是相反的。质粒PCMC1054为中间的转录和表达质粒，经组建而能转录负RNA股，与TMV基因组外壳蛋白质编码区转录的靶RNA互补。此外该载体转录的负RNA股也含有一段与TMV基因组的3′非编码区互补的区域。为了制备中间表达载体PCMC1054，以转入植物基因组，该质粒用限制性内切酶SalⅠ水解，转移载体PCMC92也同样用SalⅠ水解。该转移载体PCMC92含有A.tumefaciens的Ti一质粒中的T-DNA边缘区，还包含一个卡那霉素抗性编码基因(APH3′Ⅱ)，该基因可在植物及植物细胞中起作用能够选择具有卡那霉素抗性的植物细胞，转化DNA吸收入植物细胞，并且能够进行稳定的表达。T-DNA边缘区在图3-5中用箭头表示。图中还指明RB(右一边缘)及LB(左一边缘)。质粒PCMC92在APH3′Ⅱ基因上游还包括一系列的限制性位点(SstⅠ，SmaⅠ/XmaⅠ，BamHⅠ，XbaⅠ，SalⅠ)。PCMC92的APH3′Ⅱ基因包括一个合适的启动区(蓝曙红(nopaline合酶)及终止顺序(也为蓝曙红(nopaline)合酶)。此两片段连接在一起形成植物表达载体，称为PCMC1060，如图3下部所示。表达载体PCMC1060包含一个抗生素抗性基因(APH3′Ⅱ)及一个组成蓝曙红(nopaline)合酶(Nos)启动区和聚腺苷酸顺序的表达盒(cassette)，位于TMV顺序，包括外壳蛋白编码区的逆向定位。此外，该载体当然含有Ti质粒T-DNA的A.tumefaciens边缘区。
确定了PCMC1060的结构之后，将含有质粒的大肠杆菌与A.tumefaciens菌株LBA4404连接，优先选择A.tumefaciens结合体，因为其中含有PCMC1060质粒。然后，将A.tumefaciens菌株通过现有的茎杆接种技术转化的Havana425种的烟草组织。经茎杆接种转化烟草植物细胞选用组织培养，选择卡那霉素抗性的细胞。接着对得到的培养物进行测定，证明表达了抗生素抗性标记物(氨基糖苷3′磷酸转移酶Ⅱ)表示的基因。培养物可成功地测定上述的转化标记蛋白，并且利用规范技术这些转化了的细胞的愈伤组织培养物可以再生为完整的植株。
按上述的方法，PCMC1060转化而得到再生烟草植物中的十株，用烟草花叶病毒进行试验。采用常规方案，用普通的TMV品系对这些烟草植物进行接种。病毒混入缓冲溶液。细小的刚玉作为研磨剂与病毒相混和。将纱布浸入这种研磨剖/病毒混合物中，然后用纱布揩烟草植物的半片叶子。用实验的方法调节缓冲液病毒含量密度，直到它处于这样的水平，即在对照的非转化的Hewana425烟草中各片叶子产生大约100个病斑。这一病毒密度大约相当于可以目视的密度。每株植物上接种几片叶子。TMV病毒一般使Havanna烟草植物宿主产生局部损伤，表明TMV感染导致了局部的损伤。因而用TMV接种后，查清产生的病斑的总数目及大小，以此衡量植物对TMV的抗性。对于24株再生的转化植物，用上述方法接种，大多数的损伤数与对照植物差不多，即每片叶子大约有100个损伤。可以预期转化植物中的嵌合基因的表达的有效性是由于嵌合基因插入植物基因组的随机性而有很大的变化。其中8株对于接种的反应非同一般，表明对病毒感染的抵抗水平相当高。这8株烟草植物的病斑数目平均为对照植物的十分之一(即大约为10个病斑)，这就表明了此8株再生植物有对TMV的抵抗力。经过繁殖，目前正在对这些再生植物进行繁殖以验证一特性是否可以遗传。
TMV的另一负股RNA一个类似的方法也用于处理POMC5 H2的PstⅠ片段。质粒POM5 H2用PstⅠ水解，得到的较小的那个片段被连接到预先也用PstⅠ水解的表达质粒PCMC66上。通过这一方法，所获得的两个质粒，仅仅是在与PCMC66宿主部分有关的TMV片段的空位方向上有所不同。这两个质粒称为PCMC1052及PCMC1053。对两个质粒都作了限制性图，并证明PCMC1052携入的TMV片段位于(nopaline)蓝曙红合酶启动区及聚腺苷酸顺序有关的相反空位上。换而言之，启动区是在与基因的正常阅读方面的相反空位上，因此基因转录时能产生天然病毒RNA股互补的负股RNA。
一旦获得PCMC1052，对其的操作方法与上述的用于PCMC1050的是一样的。用PCMC1052及其子代代替了PCMC1050及其子代。所获得的转化植物再生后，用类似于上述的用于PCMC1060转化植物的方法来进行分析。
例2内源基因表达的抑制作用一蓝曙红(nopaline)合酶为了显示抑制内源性基因表达的能力，烟草病毒经选择使其携带蓝曙红(nopaline)合酶(Nos)的内源性基因。此基因在正常情况下不存在于烟草植物中，为了获得能够通过一般的基因遗传方式将完整的蓝曙红(nopaline)合酶基因传递给子代的，机体正常的具有繁殖能力的，稳定的烟草植物，再将此基因通过基因操作方法导入烟草植物。(Barton et al.，Cell 32∶1033-1043(1983))因而，为了说明这样一个原理，不妨认为该基因及其表达是内源性的。为显示对此代表性的内源性基因表型表达的抑制，组建了一条嵌合基因，该嵌合基因合成的负RNA股与位于蓝曙红合酶信使RNA(mRNA)中部的一大段互补。该嵌合基因组建后，导入取自被称为HADH植物品系的细胞的基因组中。
组建嵌合入基因及质粒转移至上述基因转化植物细胞的过程示于图5。蓝曙红合酶基因片段，通过使用claⅠ及SphⅠ共同水解质粒PCMCⅠ而获得。通过电泳将此片段从其他基因片段中分离出后，连结到预先已用AccⅠ及SphⅠ水解过的质粒pUC18上。连结后的产物称为pUCNos，位于几个有用的质粒独特的限制位点旁侧，含有蓝曙红合酶基因片段。位于质粒上的蓝曙红合酶基因为其总长度的一半以上。
然后用HindⅢ和SmaⅠ水解质粒pUCNos得到两个片段，选用其中较小的片段。该片段以特殊的取向方式连接到预先经HindⅢ及SmaⅠ水解的表达载体PCMC60相连结，从而获得与Nosm RNA互补的负股RNA的中间表达盒(cassette)，称为PCMC60Nos质粒PCMC60Nos用XhoⅠ水解以获得转化植物细胞的载体。获得的片段连接到两个载体，PCMC91及pCMC92上，而这两个载体预先都已用SalⅠ水解过。因为对这两个载体的每一个，Nos基因都可以有两个不同的插入方向，因而产生了四个转移载体，分别称为91Nos RA，91Nos RB，92Nos RA，92Nos RB，其中91及92是指用于组建的转移载体。符号A及B是指与显性的选择标记物(卡那霉素抗性基因-APH3′Ⅱ)有关的表达盒(cassette)产生的Nos负RNA股的两种可能的定向。
在HADH品种的烟草植物茎干上进行接种，选择使转化株具有卡那霉素抗性，如上的例1所述。获得了转化株培养物，并且确证了通过插入偏码Nos基因的负RNA股的基因而使之转化的推断。对所有这些培养物进行检测，未发现有蓝曙红产物。
按照以专利手续及管理为目的的国际公认的微生物存放的布达佩斯条约，下例的质粒存放于美国，MD，Rockville，American Type Culture Collection(ATCC)，按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)保存这些质粒，并且可以提供之。但是根据各国的专利法，可以提供并不意味着可以实施本发明及侵犯已授与的权力。
对于存放的质粒，给于ATCC有存放号。上述质粒也由美国加利福尼亚州，埃默里维尔市Cetus公司的Master Culture Colletion(CMCC)存放，并且给于CMCC存放号。
质粒 CMCC存放号 ATCC存放号PCMC1in E.Coli MM294 1985 39641PCMC92in E.Coli 2306 53093PCMC91in E.Coli 2307 53094PCMC1060in E.Coli 2401 53243PCMC1061in E.Coli 2400 53242上面所列的存放着的质粒PCMC1060及PCMC1061，除用于发明人在此所举的实施例外，也可以针对其他的靶RNA股，在实施本发明公开的方法时用作载体。例如，最简单地，可以用SalⅠ水解质粒PCMC1061得到两个小的质粒，PCMC1052及PCMC92，以实现与图4最后一步的相反步骤。可以通过用PstⅠ水解PCMC1052可回收质粒PCMC66，然后PCMC66及PCMC92两个质粒可用于任何编码靶RNA的DNA顺序，所编码的靶RNA关系到组建一个在植物细胞中引起所需负股RNA的转录的表达及转移质粒。
权利要求
1.一种引起高等植物体细胞变化的方法，本发明的特征在于所述的方法包括下述步骤；将一段能导致与靶RNA充分互补的负股RNA的转录的DNA顺序导入植物，以使负股RNA有效地结合到靶RNA股以抑制体内靶RNA股的活性。
2.如权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的靶RNA股为信使RNA，内源性蛋白的表达活性被抑制。
3.如权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的靶RNA股至少是病原体RNA的一部分。
4.如权利要求
3所述的方法，其特征在于所述的靶RNA股是烟草花叶病毒的RNA。
5.如权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的将DNA顺序导入植物的步骤包括下述步骤;在细菌中组建一个表达载体质粒，包括一个通常能用于植物细胞的启动区及一段至少部分编码位于启动区3′的靶DNA的DNA顺序，DNA顺序的取向与启动区的正常阅读方向相反;用来自表达载体质粒的表达载体转化培养的植物细胞，使得转化了的植物细胞转录负RNA股，并且使转化植物细胞再生，形成整株植物。
6.如权利要求
5所述的方法，其特征在于所述的转化步骤包括下述步骤用表达载体宿主与A.tumefaciens结合;选择A.tumefaciens转结合体;并用选择的A.tumefaciens感染植物细胞。
7.一种正常形态的植物，特征在于所述的植物的细胞的基因组含有一段嵌合DNA顺序，该嵌合DNA顺序可导致与靶RNA股充分互补的负RNA股的转录，因而负RNA股将专门与靶RNA股联合从而抑制植物细胞中靶RNA股的活性。
8.如权利要求
7所述的植物，其特征在于所述的靶RNA股为一段信使RNA，并且抑制的是植物细胞中内源性基因的表达活性。
9.如权利要求
7所述的植物，其特征在于所述的靶RNA股至少为病毒RNA的一部分。
10.如权利要求
7所述的植物，其特征在于所述的植物细胞中的嵌合DNA顺序包括一个通常可用于植物细胞的启动区;及一段位于启动区的3′处的DNA编码顺序，至少为靶DNA股的一部分编码DNA顺序，其定位与启动区正常阅读方向相反。
11.如权利要求
10所述的植物，特征在于所述的嵌合DNA顺序还包括一段可用于植物的、位于转录顺序3′处的聚腺苷酸顺序。
12.权利要求
7所述一种植物所产生的种子。
13.权利要求
8所述的植物所产生的种子。
14.权利要求
9所述的植物所产生的种子。
15.一个可用于植物的嵌合基因的组建过程，其特征在于，所述的组建过程包括一般可用于植物细胞的启动区顺序;及一段位于启动区3′处的DNA编码顺序，至少为植物细胞中有正常活性的靶RNA股的一部分编码，DNA编码顺序的取向与启动区正常转录方向相反，而使嵌合基因致导至少与靶RNA链部分互补的负股RNA的转录，从而抑制植物体内靶RNA股的活性。
16.如权利要求
15所述的嵌合基因，其特征在于所述的嵌合基因还包括一段一般可用于植物的位于DNA编码顺序的3′处的聚腺苷酸顺序。
专利摘要
公开一种方法，该方法通过在植物细胞中转录与靶RNA股充分互补的负RNA股，使植物体细胞发生有益的变化。靶RNA股可以是基因表达中转录的mRNA、病毒RNA或是植物细胞中存在的其他RNA。负RNA股至少与靶RNA股部分互补，从而抑制其在植物体内的活性。
文档编号A01H5/00GK86107039SQ86107039
公开日1987年4月15日 申请日期1986年10月16日
发明者弗朗西斯·麦克科米科, 肯尼思·A·巴顿, 威廉·F·史惠恩 申请人:阿格拉塞特斯导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan