一种与酪氨酸磷酸酶抗体特异结合的抗原蛋白质的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及抗原-抗体蛋白质的技术领域，特别设及用于检测糖尿病的截短的酪 氨酸磯酸酶（IA-2)的技术领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种因膜岛素分泌绝对或相对不足而引起的高血糖症为主要特征的代 谢性疾病，受多种遗传和环境因素影响。按照1997年美国糖尿病协会及1999年世界卫生 组织（WHO)关于糖尿病分类及诊断标准，糖尿病可分为I型、II型、特殊类型糖尿病和妊娠 糖尿病。
[0003] 在1型糖尿病的免疫破坏期间，患者体内会产生多种针对膜岛细胞自身抗原的自 身抗体。自20世纪70年代W来，已经发现了多种膜岛素自身抗体，例如；膜岛细胞抗体 (ICA)、膜岛细胞表面抗体（ICSA)、膜岛素抗体（IAA)、热休克蛋白抗体化SP)、谷氨酸脱駿 酶65佑AD65,哺乳动物中GAD的存在形式之一）抗体、蛋白质酪氨酸磯酸酶抗体（IA-2A) 等。目前临床上在诊断1型糖尿病常用的指标包括ICA、IAA、GADA、IA-2A。
[0004] 目前临床上体外诊断1型糖尿病指标所用的平台都基于放免或酶联免疫技术 巧LASA)，自身免疫性1型糖尿病诊断试剂在敏感性和特异性方面有待于进一步改进。传统 的放射免疫或者化ISA方法检测时间长，至少6个小时，甚至过夜反应才能完成测试，主要 依靠纯手工加样等系列操作，效率低，特异性不足。化学发光系统有高灵敏度、高特异性的 优势，检测结果时间快、效率高，全程全自动仪器自动操作，1个小时即可完成测试，对现在 医院的及时诊断治疗起非常大的作用。
[0005] 随着敏感性和特异性更高的化学发光技术在体外诊断中的应用，开发能适用于化 学发光封闭系统的抗原变得尤其重要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是筛选出与酪氨酸磯酸酶（IA-2)抗体特异结合的截短的抗原 蛋白质。目的之二是开发能满足应用于化学发光封闭系统的抗原蛋白，并应用于化学发光 封闭系统。
[0007] 截短的抗原蛋白质的表达与全长蛋白质的表达相比，截短后的蛋白更容易表达， 表达量更高；在用于检测糖尿病时，其与全长蛋白质相比，截短后的蛋白灵敏度更好；非特 异性更低。
[000引本发明提供了一种与糖尿病特定抗体特异结合的抗原蛋白质，所述抗原蛋白质选 自如 SEQ ID NO: 17 中的第 600-979、604-979、604-969、600-969 和 709-969 位的截短蛋白 质中的一种。
[0009] 在一个具体的实施例中，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO: 17中的第604-969、 600-969和709-969位的截短蛋白质中的一种。
[0010] 在一个具体的实施例中，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID N0:17中的第709-969位 的截短蛋白质。
[0011] 在一个具体的实施例中，所述抗原蛋白质为真核表达系统获得的蛋白质。
[0012] 在一个具体的实施例中，所述抗原蛋白质为昆虫细胞表达系统获得的蛋白质。昆 虫细胞表达系统是应用较多的真核表达系统，它可W在昆虫细胞中表达多种外源基因，包 括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆状病毒是一类W昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒， 具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对人、畜无害。目前研究较多的是首猜银纹夜蛾 核多角体（AcNPV)，其宿主是草地贪夜蛾。而SF9细胞，正是杆状病毒表达系统的宿主细胞 之一。SF9细胞属于半贴壁型细胞系，可W进行悬浮培养，也可W进行贴壁培养，在应用于蛋 白的表达与制备纯化中，有许多的优点；1)与其他真核表达系统相比，外源基因表达水平 高，特别是细胞内蛋白。多数情况下，表达的重组蛋白可溶，折叠正确有翻译后修饰（如糖 基化等），有生物学活性，容易分离纯化；2)利用昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于 大规模表达重组蛋白；3)易于表达异源多聚体蛋白，可通过多种重组病毒同时感染昆虫细 胞或用含有多个表达框的一种病毒感染昆虫细胞来实现；4)昆虫杆状病毒不感染脊椎动 物，具有安全性。
[0013] 本发明还提供了一种抗原蛋白质，所述抗原蛋白质为上述截短型的蛋白质或IA-2 的全长蛋白质，且所述蛋白质为纳米磁珠包被的蛋白质。
[0014] 本发明又提供了一种用于检测糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括一种抗原蛋白 质，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO:17中的第600-979、604-979、604-969、600-969和 709-969位的截短蛋白质中的一种。
[0015] 在一种具体的实施例中，所述试剂盒中的所述抗原蛋白质选自如SEQ ID NO: 17中 的第604-969、600-969和709-969位的截短蛋白质中的一种。
[0016] 在一个具体的实施例中，所述抗原蛋白质选自如SEQ ID N0:17中的第709-969位 的截短蛋白质。需要指出的是，在检测抗体的过程中，所选用的抗原蛋白质并非全长蛋白 质是最优的，因为虽然全长蛋白质包含了更多的抗原决定簇，该样能够更容易的识别其相 应的抗体，但是由于全长蛋白质包含较多的抗原决定簇，也会带来非特异性增高的结果；此 夕F，蛋白质的片段长度越长，其表达难度W及后续的纯化等一系列的操作的难度也会相应 的越高。因此，优选的抗原蛋白质应该是首选满足灵敏性和特异性的前提下，蛋白质的片段 越短则越有利于应用于实际。例如，在化学发光法的检测系统中，用于检测糖尿病的IA-2 抗体的最优的蛋白质为如SEQ ID NO: 17中的第709-969位的截短蛋白质。
[0017] 在一个具体的实施例中，所述试剂盒中的所述抗原蛋白质为在真核表达系统中表 达而获得的蛋白质。
[0018] 在一个具体的实施例中，所述试剂盒中的所述抗原蛋白质为在昆虫细胞表达系统 中表达而获得的蛋白质。
[0019] 在一个具体的实施例中，所述试剂盒中的所述抗原蛋白质为纳米磁珠包被的蛋白 质。
[0020] 在一个具体的实施例中，所述试剂盒中还包括化学发光标记的蛋白A。利用化学发 光法可W提高产品的灵敏度和特异性。其中，蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质， 能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG)的化区结合。
[0021] 在一个具体的实施例中，所述试剂盒中还包括所述试剂盒中还包括BSA缓冲液。 所述