扩增子文库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种扩增子文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研宄有着十分重要的意义。第一代 测序仪对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和并行化程度，也难以 通过微型化降低测序成本。经过不断的技术开发和改进，21世纪初，以Roche 454技术、 illumina公司的Genome Analyzer技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技 术诞生了。第二代技术大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确 性。其中，illumina公司的第一台测序仪于2006年问世，之后开发出来一系列的测序仪，如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、Hiseq X等，在准确性、通量、成本和速度方面表现更优秀，而 使其成为全球使用量最大的第二代测序仪。在第二代测序平台不断完善的同时，以对单分 子DNA进行非PCR测序为主要特征的第三代测序技术也初显端倪。但由于其关键技术问题 尚待解决，目前还未得到广泛应用。
[0003] 环境中微生物的群落结构和多样性是微生物生态学的研宄热点。微生物多样性的 研宄涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。传统研宄手段存在实验操作 费时费力、不可培养性、无法检测痕量微生物、无法探索未知等的局限性。第二代高通量测 序技术，尤其是illumina Miseq高通量测序技术的成熟和普及，使我们能够对环境微生物 进行深度测序，灵敏地检测环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，精确指 导不同环境微生物的构成。
[0004] 16S rDNA是编码细菌核糖体小亚基的DNA序列，分子大小约1540bp，由9个可变 区和10个保守区交叉排列组成。保守区能反映物种间亲缘关系，可变区在不同菌种间存在 差异。根据保守区序列设计引物，将可变区扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库 的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的细菌种类。研宄表 明，V4靶基因区域（约300bp)对微生物进行分类较为准确。
[0005] ITSl是位于真核生物的18S rRNA和5. 8S rRNA之间的内转录区域，ITS2位于真核 生物的5. 8S rRNA和28S rRNA之间的内转录区域。由于进化相对于18S rRNA、5. 8S rRNA 和28SrRNA迅速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学研宄。根据保守区序列设 计引物，将其扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进 化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的真菌种类，是目前非常常见的分析真菌方法。
[0006] 扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，不仅包括16S rDNA测序，还包括18S rDNA测序、ITS测序及功能基因检测等。采用illumina MiSeq第二 代高通量测序平台对来源于不同环境的样本进行16S/18S/ITS中某个高变区域深度测序， 能灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的变化而发生的极其微弱的变化，对于我 们研宄微生物与环境的关系，环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。
[0007] 为进行微生物扩增子区域的测序，首先需要对目标样本进行PCR扩增，然后构建 适用于二代测序平台的文库。目前的扩增体系主要有20ul和50ul两种，体系中模板量的 添加一般为经验值，并没有一个确定的量，波动性较大，对扩增结果也影响较大。同时退火 温度则根据引物的不同而不同，一般在50-60°C之间。利用现有扩增技术对上述扩增子进 行扩增，合格率低且非特异性条带较多。对于难扩增的ITSl和ITS2区域扩增一般使用的 Touchdown技术（65-50 °C )，对PCR仪要求较高。
[0008] 因此，仍需要对现有的针对微生物扩增子的扩增方法进行改进，以降低扩增子文 库中非扩增子的含量，提高扩增子文库的合格率，降低文库构建成本。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种微生物扩增子文库的构建方法，以降低扩增子文库中非扩增子 的含量，提高扩增子文库的合格率，降低文库构建成本。
[0010] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种微生物扩增子文库的构 建方法，该构建方法包括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集的目的片段；以及 S2,对富集的目的片段进行片段化文库构建，得到扩增子文库；其中，步骤Sl包括以下步 骤：S11，对目的片段的扩增模板进行定量；S12,对目的片段的扩增引物的退火温度进行固 定；以及S13,利用扩增引物在退火温度下对目的片段进行扩增，得到富集目的片段。
[0011] 进一步地，目的片段为16SV4、ITSl或ITS2。
[0012] 进一步地，当目的片段为16SV4时，扩增引物为SEQ ID NO: 1所示的正向引物： GTGCCAGCMGMWGCGGTAA ;以及 SEQ ID N0:2 所示的反向引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。
[0013] 进一步地，扩增引物的退火温度为48?52°C，优选为50°C。
[0014] 进一步地，当目的片段为16SV4时，扩增模板为10-20ng。
[0015] 进一步地，当目的片段为ITSl时，扩增引物为SEQ ID N0:3所示的正向引物： GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG ;以及 SEQ ID 勵:4所示的反向引物：6(^6061'1'(：1'1^六1^6六了6(：。
[0016] 进一步地，扩增引物的退火温度为55?56°C，优选为55. 3°C。
[0017] 进一步地，当目的片段为ITSl时，扩增模板为20_30ng。
[0018] 进一步地，当目的片段为ITS2时，扩增引物为SEQ ID N0:5所示的正向引物： GCATCGCATAAGAACGCAGC;以及SEQIDN0:6所示的反向引物：TCCTCCCCATATTGATATGC ;优选 扩增引物的退火温度为56?58°C，更优选为57. 6°C。
[0019] 进一步地，当目的片段为ITS2时，扩增模板为15-50ng。
[0020] 应用本发明的技术方案，通过对来自于不同环境的核酸样本进行准确定量扩增体 系中的模板量，使得不同样本间目的片段的扩增效率相当，因而使产生的测序数据的波动 性降低；通过对所用引物的退火温度进行优化，实现了利用普通PCR仪，经过简单操作，提 供了一种目的片段扩增合格率高、非特异条带少的扩增文库构建方法。本发明的上述方法 不仅降低扩增子文库的构建成本，而且降低扩增子文库中的非特异扩增子的比例，提高了 扩增子文库的合格率。
【附图说明】
[0021] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0022] 图1示出了根据本发明的一种典型实施方式中扩增子文库构建的流程示意图； [0023] 图2示出了根据本发明的实施例1所提供的16SV4扩增子的电泳检测结果图； [0024] 图3示出了根据本发明的实施例2所提供的ITSl扩增子的电泳检测结果图；以及
[0025] 图4示出了根据本发明的实施例3所提供的ITS2扩增子的电泳检测结果图。
【具体实施方式】
[0026] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0027] 正如【背景技术】部分所提到的，现有技术的微生物扩增子文库构建方法中，文库构 建合格率低且不同样本间测序数据波动性较大的缺陷，为了改善上述状况，在本发明一种 典型的实施方式中，提供了一种微生物扩增子文库的构建方法，如图1所示，该构建方法包 括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集目的片段；以及S2,对富集的目的片段进 行片段化文库构建，得到扩增子文库；其中，步骤Sl包括以下步骤：S11，对目的片段的扩增 模板进行定量；S12,对目的片段的扩增引物的退火温度进行固定；以及S13,利用扩增引物 在退火温度下对目的片段进行扩增，得到富集目的片段。
[0028] 在本发明的上述构建方法中，通过对来自于不同环境的核酸样本进行准确定量扩 增体系中的模板量，使得不同样本间目的片段的扩增效率相当，因而使产生的测序数据的 波动性降低；通过对所用引物的退火温度进行优化，实现了利用普通PCR仪，经过简单操 作，提供了一种目的片段扩增合格率高、非特异条带少的扩增文库构建方法。本发明的上述 方法不仅降低扩增子文库的构建成本，而且降低扩增子文库中的非特异扩增子的比例，提 高了扩增子文库的合格率。
[0029] 在本发明的上述构建方法中，是一种适用于环境微生物扩增子的高效扩增方法， 能在普通的PCR设备上完成扩增，不仅扩增合格率高，而且在扩增中产生的非特异性条带 少。上述扩增子即目的片段，根据研宄目的的不同，可以是不同的基因或基因组片段。在本 发明一优选的实施例中，上述目的片段可以是16SV4、ITSl或ITS2。上述三个目的片段能 够根据其片段中的某个高变区来体现环境中微生物的多样性或环境中微生物群落结构随 外界环境的变化。
[0030] 在本发明的上述构建方法中，当目的片段为16SV4时，扩增引物为SEQ ID NO: 1所示的正向引物：GTGCCAGCMGMWGCGGTAA ;以及SEQ ID NO:2所示的反向引物： GGACTACHVGGGTWTCTAAT。上述引物是根据其保守序列进行设计，引物之间扩增的目的片段 是不同物种间的可变区，采用上述引物能够将不同环境中的16SV4的可变区都扩