检测乳头瘤状病毒hpv6型的pcr试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病毒TapMan荧光定量检测试剂盒，确切讲是一种用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型一步法TapMan荧光定量PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]青少年复发性呼吸道乳头瘤状瘤(juvenile-onset recurrent respiratorypapilloma, JO-RRP)特指发生于上下呼吸道的乳头瘤病，是一种由乳头瘤状病毒(humanpapillomavirus, HPV)病毒引起的具有高度复发性及侵袭性的疾病，除时常累积喉部之外，还可以侵犯呼吸道其他部位和消化道。RRP的病程表现多样，个别患儿可以自发缓解，多数则呈现侵润生长并需要多次手术甚至出现喉、气管狭窄梗阻窒息死亡，临床治疗十分棘手。
[0003]HPV是一种嗜上皮小型DNA病毒，具有宿主和组织特异性，只感染人的皮肤和黏膜，经密切接触可传染他人，人乳头瘤状病毒感染的部位与HPV类型及抗体因素有关。目前已发现100种以上已知的HPV基因型，国际癌症研究中心根据HPV致病力的大小分为两型，即引起良性增生的低危险型(包括即￥6、11、40、42-45、54、61、70、72、81型)及与人类多种组织恶性肿瘤密切相关的高危型(包括册￥16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59等)，与JORRP发病有关的是HPV6和11型。
[0004]研究认为HPV的亚型与病情严重程度和临床经过相关，而且亚型之间存在毒力和组织嗜性差异，因此临床上建立能够快速检测青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒HPV6亚型的方法显得尤为重要。但至今尚无用于检测病毒的检测试剂盒，常规常规PCR方法检测灵敏度不高，且易出现假阳性。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种可检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型病毒的高度特异性引物对，以及包括有这一高度特异性引物对及探针的可特异、敏感、快速和便捷的用于定量检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型的试剂盒。
[0006]本发明的可检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型病毒的高度特异性引物对基因序列为 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2。
[0007]本发明的可检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型病毒的试剂盒，内包括有基因序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的高度特异性引物对和基因序列为SEQ ID N0.3的探针引物。为方便使用，本发明的试剂盒内除含有特异性引物SEQ ID N0.1,SEQ ID N0.2和特异性探针SEQ ID N0.3外，还含有其它的附属物如:2X0ne Step RT-PCR Buffer III(含 dNTP Mixture,Mg2+)、TaKaRa Ex Taq HS (5U/μ L)、PrimeScript RT Enzyme Mix II 等扩增所需要的所有实验试剂，检测时只需按照说明加入检测样品即可。以及不含青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型的DNA阴性样品和作为阳性对照的含有青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型的DNA样品。
[0008]使用本发明所述的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2引物对扩增条件为:95 °ClOsec，I 个循环—95°C 10sec,55°C 30sec,72°C 30sec，40 个循环；进行一步法 TapMan 荧光定量PCR扩增时荧光信号收集放置在每个循环的72°C 30sec末端。
[0009]本发明中样品DNA的提取用Omega DNA提取试剂盒(货号:D3096)提取，取提取的DNA样品取2 μ L可直接加入分装于8连管中的反应液中(23 μ L)，这样可直接用于定量检测。
[0010]本发明的试剂盒是一种可对青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型病毒进行一步法TapMan荧光定量PCR检测的试剂盒，其优点在于于根据青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型流行株的LI基因保守涉及到两条高度特异性引物和探针，在该病毒DNA提取的基础上，对组织样品进行荧光定量PCR扩增，实现对青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型的定量检测。
[0011]一步法TapMan荧光定量PCR检测法是使用5'端带有荧光物质，3'端带有淬灭物质的TapMan探针进行荧光检测，当探针完整时，5'端荧光物质受到3'端淬灭物质的制约，不能发出突光。而当TapMan探针被分解后,5'端的突光物质便会游离出来,发出突光。在PCR反应中探针和模板杂交，延伸是聚合酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，从而可以达到检测PCR产物扩增量的目的。在PCR使用本试剂盒进行Real Time PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。
[0012]本发明用到的TaqMan探针法为针对青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒HPV6亚型特异的核苷酸序列设计的探针，探针与模板是高度特异性结合，特异性和敏感性均高。在评价青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒HPV6亚型的临床病程的发展趋势上及快速检测上填补了空白
本发明的试剂盒可使检测PCR扩增一步完成，简化了操作步骤，减少污染几率，并能提高了检测的精准度，一步法TapMan荧光定量在扩增完成后可直接进行标准曲线定量起始病毒拷贝数，同时其操作简单快捷，在评价青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒HPV6亚型的临床病程的发展趋势上及流行病学调查中的十分适用。
【附图说明】
[0013]图1:含青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型LI基因序列重组质粒酶切鉴定电泳图，
其中:M:2000bp DNA Marker
1:重组质粒pMD-Hpv6-Ll双酶切鉴定
2:重组质粒pMD- Hpv6-Ll单酶切线性化
图2:HPV6 一步法TapMan荧光定量PCR的扩增曲线，其中:纵坐标代表荧光量，横坐标代表循环数扩增曲线从左到右表示目的DNA的拷贝数分别为3.llX108-3.1lXlO3;
图3:HPV6病毒一步法TapMan荧光定量PCR检测标准曲线，其中:纵坐标代表Ct值。横坐标代表样品的拷贝数，相关系数R2 = 0.999，扩增效率Eff:98.6% ；
图4:是检测方法特异性的扩增曲线；
图5:是检测方法敏感性的扩增曲线，其中:纵坐标代表荧光量，横坐标代表循环数，扩增曲线自左到右的DNA的拷贝数分别为I X 18-1 X 10°。
【具体实施方式】
[0014]以下结合具体实例和【附图说明】对本发明做进一步说明
实施例1.青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型荧光定量PCR引物的设计与合成利用已知的青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型LI基因序列比对后，根据保守区域利用Primer Express3.0软件设计引物和探针,送宝生物工程(大连)有限公司合成。上下游引物及探针分别为:
SEQ ID N0.1:(Hpv6-F)5，- TCCTCCTAACCCTGTATC -3，
SEQ ID N0.2:(Hpv6-R)5’ - TGCTGGCATGATAAAATATG -3，