> SEQ ID N0.3: (Hpv6-Probe) 5’- CCACGGATGCTTATGTTACTCGCT -3’(5 ' FAM,3' TAMRA)
实施例2.标准品的制备
参考青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型在NCBI上登陆的序列，通过比较分析后，设计出能扩增LI基因的部分序列的上下游引物，送宝生物工程(大连)有限公司合成。上下游引物分别为:SEQ ID N0.4:(Hpv6-5674-F)5’- TGGACGACCAGCTCTTCCTTAAACAC-3’ SEQ IDN0.5:(Hpv6-6807-R) 5’ -AGTGCAAGTCTGGGTTGCAGCCAACA-3’。
[0015]取呼吸道乳头瘤组织在生物安全柜中，研磨稀释后，按照Omega DNA提取试剂盒(货号:D3096)说明书提取组织的DNA (用过的器皿和耗材需严格消毒)，然后使用TaKaRa公司一步法PCR试剂盒操作如下:
以DNA提取物为模板进行PCR扩增配制25 μ I体系，
2X1 step buffer (含 dNTP)13 μ L
PrimeScript I Step Enzyme Mix IuL 上游引物(Hpv6-5674-F) 0.5 μ L 下游引物(Hpv6-6807-R)0.5 μ L
DNA提取物(模版)IyL
DNAse Free dH209 μ L
混匀、低速离心后置PCR自动扩增仪中，按照如下程序扩增:50°C 30min,94°C 2min一个循环一94°C 30sec,52°C 30sec,72°C 45sec 35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，利用T4连接酶与pMD-20-T Vector 16°C过夜连接，转化DH5 α感受态细胞，挑单克隆斑于LB (Amp+)中扩大培养,用质粒提取试剂盒提纯质粒pMD-Hpv6-Ll,通过分酶切鉴定，确定阳性质粒，见附图1。再通过测序鉴定，将成功构建的阳性质粒pMD-Hpv6-Ll大量提取后用EcoRY单酶切将其线性化，纯化测定浓度后于_80°C冻存。利用公式:(copies/μ L) = [(ng 数 ΧΙΟ—9) X (6.02 X 123) ] + (碱基数 X 340)换算出目的 DNA的拷贝数。
[0016]实施例3.标准曲线的建立
根据定量后得到的拷贝数，将标准样品制成等6个梯度稀释的检测标准品，为降低误差，提高实验的可重复性，每个稀释度样品都设有三个重复孔，确定Ct值(Ct即cyclethreshold，指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时的所经历的循环数)，从而确定扩增效果最好的标准曲线。
[0017](I)荧光定量PCR扩增
扩增体系为 25 μ L，其中包含 2 X One Step RT-PCR BufferIII (含 dNTP Mixture，Mg2+)、TaKaRa Ex Taq HS (5U/ μ L)、PrimeScript RT Enzyme Mix I1、DNAse Free dH20、上游引物SEQ1、下游引物SEQ2
探针SEQ ID N0.3、和稀释好的标准品2 μ L。
[0018]PCR扩增采用 Agilent Techologies-Mx3005pPCR扩增仪，程序为:95°C 1sec, I个循环(反转录)
950C 1sec, 55°C 30sec，72°C 30sec，40 个循环(PCR 扩增)
其中荧光信号收集设置在每一循环的72°C 30sec末。
[0019](2)标准曲线的制备
PCR荧光信号的分析采用安捷伦公司MxP1软件，所得到的荧光定量PCR扩增曲线以及相应的标准曲线分别见附图2、3。
[0020]实施例4.特异性的检测
用下属常见疫病病原:黏膜低危险型HPV11、黏膜高危险型HPV16、皮肤低危险型HPV1、皮肤高危险型HPV5，检测已建立方法的特异性，所得到的荧光定量PCR结果见附图4。结果显示该方法只能特异性的扩增出猪青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型DNA阳性对照，特异性好。
[0021]实施例5.敏感性的检测
将标准样品制成Ix18-1x11 (copies/μ l)8个稀释度，检测已建立方法的敏感性，所得到的荧光定量PCR结果见附图5。为确保检测的准确性，设置高压灭菌水为本底值对照，将< 34个循环的且曲线有明显的指数增长期的样品判定为阳性，此荧光定量检测方法能准确检测到约10个拷贝的病原，而普通PCR智能检测到IXlO4个拷贝，由此可见本发明的荧光定量PCR的检测敏感性是普通PCR的13倍，敏感性好。
【主权项】
1.一种可检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型病毒的高度特异性引物对，其特征是引物对基因序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2。
2.一种可检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型病毒的试剂盒，其特征在于试剂盒内包括有基因序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的高度特异性引物对和基因序列为SEQ ID No3的探针引物。
3.根据权利要求2所述的可检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型病毒的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有本发明的试剂盒其特征在于试剂盒内还含有RT-PCR Buffer II1、TaKaRa Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme Mix II,以及不含青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型的DNA样品和作为阳性对照的含有青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型的DNA样品。
4.使用权利要求1或2或3所述的SEQID N0.1和SEQ ID N0.2引物对扩增条件为:95°C lOsec，I 个循环—95°C 10sec，55°C 30sec，72°C 30sec，40 个循环；进行一步法TapMan荧光定量PCR扩增时荧光信号收集放置在每个循环的72°C 30sec末端。
【专利摘要】本发明公开用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型的高度特异性引物对，和用于青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型一步法TapMan 荧光定量PCR检测试剂盒。发明的用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒的高度特异性引物对序列分别为SEQ ID No.1和 SEQ ID No.2，检测试剂盒内还有序列为 SEQ ID No.3的探针。发明可对青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV6亚型定量扩增、检测，可减少污染、提高了检测的精准度、操作简单快捷，在评价青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒HPV6亚型的临床病程的发展趋势上及流行病学调查中的十分适用。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-93, C12N15-11
【公开号】CN104561385
【申请号】CN201510036404
【发明人】郑海学, 曹伟军, 杨帆, 朱紫祥, 郭建宏, 靳野, 李丹, 刘湘涛
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月24日