呼吸系统常见病原体的实时荧光多重pcr快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及呼吸系统常见病原体的实时荧光多重 PCR快速检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 呼吸道感染是我国的常见病、多发病，感染的病原有细菌、病毒、支原体等，感染者 从感冒到肺炎，可呈现不同的症状，引发严重的合并症甚至死亡。
[0003] 呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，前者表现为急性鼻炎、咽炎和喉 炎，后者表现为急性气管炎、支气管炎和肺炎。上呼吸道感染的感染原因可以是细菌或真 菌。90%左右由病毒引起，细菌感染常继发于病毒感染之后。下呼吸感染的病因主要是细菌 和真菌。由于病毒的类型较多，人体对各种病毒感染后产生的免疫力较弱且短暂，并无交叉 免疫，同时在健康人群中有病毒携带者，故一个人一年内可有多次发病。据某省中医院急诊 科统计，以发热就诊的病人占急诊门诊总数的40%左右，其中急性病毒性上呼吸道感染发 热患者约就占其中的80%以上。因此，对呼吸道病原体的快速、准确的诊断十分必要。在成 年人和儿童中，急性呼吸道感染是最普遍的急性传染病，并且病原体种类繁多，这就给诊断 带来巨大挑战。
[0004] 目前，临床上最准确的呼吸道病原体检测方法为病毒培养，具有特异性高的特点， 是临床诊断的"金标准"。但培养法耗时、敏感性低、对实验操作要求高。此外还有细菌培养 和药敏法，可以监测耐药情况，但样本易污染，对结果影响大；病毒抗原的测定可作为感染 证据，检测快速，但敏感性低，且不能区分污染和定植菌；特异性抗体检测，可作早期诊断， 特异性及敏感性高，但受到抗体动力学的影响。荧光核酸PCR技术具有敏感性高，检测快速 等优点，预期将会在临床诊断中有广泛的应用。然而，传统的荧光实时PCR每次只能扩增一 种病原体的核酸，要准确找出致病病原体需多次尝试，耗费大量的时间和精力，并且对于多 种病原体导致的感染无法有效区分。新型的多重实时荧光PCR可以有效弥补单重PCR的这 些缺陷，是一种非常有应用前景的诊断方法。
[0005] 要成功实施多重PCR，需要解决几个技术问题：(|)由于每一种扩增子的最佳扩增 条件都不一样，需要协调每个单独反应的条件以保证在单一扩增条件下各扩增子都能进行 成功扩增。（g由于需要使用多组引物/探针组合，不同引物/探针之间互相产生交联的可 能性很大，因此在设计时需要考虑消除这一可能性。i:gl_组引物/探针不能对其他目标和 非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性的结果，影响对疾病的诊断。Γ?)需要有 一定的方法来排除来自于核酸提取方面的问题，这就要求有内对照作为参考。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是解决不同引物/探针之间互相产生交联的问题，提供呼吸系统常 见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，能够快速、精确、有效的进行测定。
[0007] 本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：呼吸系统常见病原体的实时荧光多 重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，该试剂盒内还设有用 于检测流感A病毒、HlNl亚型病毒、流感B病毒、鼻病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、冠 状病毒NL63、冠状病毒0C43、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、人博卡病毒、人偏 肺病毒、副流感病毒1、肺炎支原体、腺病毒、肠病毒、双埃可病毒和呼吸道合胞病毒中一种 或多种病原体的多种引物及探针的混合物，其中，用于流感A病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :3,荧光标记为FAM ;用于 HlNl亚型病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，Taqman探针序列 为SEQ ID NO :6,荧光标记为Cy5;用于流感B病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :7 和SEQ ID NO :8，Taqman探针序列为SEQ ID NO :9,荧光标记为ROX ;用于鼻病毒检测的引 物序列分别为SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :12,荧 光标记为VIC ;用于冠状病毒229E检测的引物序列分别为SEQ ID NO :13和SEQ ID NO : 14 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO : 15,荧光标记为FAM ;用于冠状病毒HKUl检测的引物序 列分别为SEQ ID NO :16和SEQ ID NO :17 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :18,荧光标 记为ROX ;用于冠状病毒NL63检测的引物序列分别为SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20， Taqman探针序列为SEQ ID NO :21，荧光标记为VIC ;用于冠状病毒0C43检测的引物序列分 别为SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :23，Taqman探针序列为SEQ ID NO :24,荧光标记为 Cy5;用于副流感病毒2检测的引物序列分别为SEQ ID NO :25和SEQ ID NO :26 ,Taqman 探针序列为SEQ ID NO :27,荧光标记为VIC ;用于副流感病毒3检测的引物序列分别为SEQ ID NO :28和SEQ ID NO :29，Taqman探针序列为SEQ ID NO :30,荧光标记为FAM;用于副 流感病毒4检测的引物序列分别为SEQ ID NO :31和SEQ ID NO :32，Taqman探针序列 为SEQ ID NO :33,荧光标记为ROX ;用于人博卡病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :34 和SEQ ID NO :35, Taqman探针序列为SEQ ID NO :36,荧光标记为ROX ;用于人偏肺病毒 检测的引物序列分别为SEQ ID NO :37和SEQ ID NO :38, Taqman探针序列为SEQ ID NO :39,荧光标记为VIC ;用于副流感病毒1检测的引物序列分别为SEQ ID NO :40和SEQ ID NO :41 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :42,荧光标记为FAM ;用于肺炎支原体检测的引物 序列分别为SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :44 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :45,荧光标 记为Cy5;用于腺病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :46和SEQ ID NO :47 ,Taqman 探针序列为SEQ ID NO :48,荧光标记为Cy5;用于肠病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :49和SEQ ID NO :50, Taqman探针序列为SEQ ID NO :51，荧光标记为ROX ;用于双埃 可病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :52和SEQ ID NO :53, Taqman探针序列为SEQ ID NO :54,荧光标记为VIC ;用于呼吸道合胞病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :55 和SEQ ID NO :56，Taqman探针序列为SEQ ID NO :57,荧光标记为FAM;所述的内对照为马 动脉炎病毒，用于马动脉炎病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :58和SEQ ID NO :59 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO :60,荧光标记为Cy5。
[0008] 有益效果 本发明所涉及的检测试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组 引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测 多种引起呼吸系统感染的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提 供了有力的检测工具。
【具体实施方式】
[0009] 呼吸系统常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对 照、阴性对照和内对照，该试剂盒内还设有用于检测流感A病毒、HlNl亚型病毒、流感B病 毒、鼻病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒0C43、副流感病毒2、 副流感病毒3、副流感病毒4、人博卡病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1、肺炎支原体、腺病毒、 肠病毒、双埃可病毒和呼吸道合胞病毒中一种或多种病原体的多种引物及探针的混合物， 其中，用于流感A病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ,Taqman探 针序列为SEQ ID NO :3,荧光标记为FAM ;用于HlNl亚型病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :6,荧光标记为Cy5;用于流感 B病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，Taqman探针序列为SEQ ID NO :9,荧光标记为ROX ;用于鼻病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :12,荧光标记为VIC ;用于冠状病毒229E检测的引物 序列分别为SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :15,荧光 标记为FAM ;用于冠状病毒HKUl检测的引物序列分别为SEQ ID NO :16和SEQ ID NO : 17 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :18,荧光标记为ROX ;用于冠状病毒NL63检测的引物序 列分别为SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20 ,Taqman探针序列为SEQ ID NO :21，荧光标 记为VIC