流感病毒a型、b型联合检测引物、探针、试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及流感病毒的分子生物学检测技术领域，具体涉及流感病毒A型、B型联 合检测引物、探针、试剂盒及应用。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒病毒（influenza virus)，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感 病毒，人流感病毒分为甲（A)、乙（B)、丙（C)三型，是流行性感冒（流感）的病原体。感染 鸟类、猪等其它动物的流感病毒，其核蛋白的抗原性与人甲型流感病毒相同。
[0003] 近年来发现流感不仅严重危害禽类、猪等动物，尤其是可以感染人并致人死亡，极 大地威胁着人类公共卫生安全。流感病毒的遗传物质由8个大小不等的独立单股负链RNA 片段组成。其中第7个节段即M基因全长为1027bp，编码2种蛋白Ml和M2。在M基因编 码的蛋白中，Ml蛋白具有种群特异性，是病毒分类和诊断的基础。
[0004] 目前，检测流感病毒的方法包括病毒的分离和培养、血清学诊断、免疫荧光法、酶 联免疫吸附（ELISA)等，但这些方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定不足。核酸检测技 术由于灵敏性和特异性较高，已经成为流感病毒检测的常用方法。相比常规RT-PCR，荧光定 量PCR技术（real-time RT-PCR)具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理，能有效避免交 叉污染并提高检测效率。
[0005] 然而，目前基于RT-PCR检测流感病毒的方法都要进行病毒RNA提取，然后以RNA 为模板进行检测。这一 RNA提取步骤无疑大大增加了检测工作量、时间和成本，难以实现高 通量检测。此外，提取RNA的过程仍容易发生RNA降解或交叉污染等事件；且对于痕量样 本，提取RNA仍存在较大困难。因此，现有的基于RT-PCR检测流感病毒的方法还有待于改 进和发展。
[0006] 为了提高流感病毒检测效率、节省成本、避免交叉污染并进行高通量检测，一种较 好的解决方案是设法实现流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测，即直接以采集的液 体样本作为检测对象进行RT-PCR反应，同时检测流感病毒A型和B型。然而，受限于引物 和探针易受样本复杂因素的影响，目前还没有找到可以这样使用的引物和探针。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种流感病毒A型、B型联合检测引物、探针、试剂盒及应用。本发明 用于RT-PCR中，克服了传统RT-PCR需要提取RNA这一繁琐步骤的不足，减少操作步骤，可 以同时检测流感病毒A型和B型，提高检测效率，节省成本，有效避免交叉污染，能进行流感 病毒的高通量检测，对快速发现流感疫情，及时制定防控措施具有重要的意义。
[0008] 根据本发明的第一方面，本发明提供一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测 引物，所述引物的序列如 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 所示。
[0009] 根据本发明的第二方面，本发明提供一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测 探针，所述探针的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示。
[0010] 作为本发明的优选方案，所述探针SEQ ID NO: 3的3'端结合有BHQl (Black Hole Quencher-1，黑洞泮灭染料-1)突光泮灭基团，5'端结合有FAM(6_carboxy-fluorescein, 6-羧基荧光素）荧光报告基团；所述探针SEQ ID NO: 6的3'端结合有BHQl荧光淬灭基团， 5'端结合有ROX(Carboxy-X-Rhodamine)突光报告基团。
[0011] 根据本发明的第三方面，本发明提供一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测试 剂盒，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5所示，所述探针的序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:6所示。
[0012] 作为本发明的优选方案，所述探针SEQ ID NO:3的3'端结合有BHQl荧光淬灭基 团，5'端结合有FAM荧光报告基团；所述探针SEQ ID NO: 6的3'端结合有BHQl荧光淬灭 基团，5'端结合有ROX荧光报告基团。
[0013] 作为本发明的优选方案，所述试剂盒还包括反转录酶和Taq DNA聚合酶。优选地， 所述反转录酶和Taq DNA聚合酶具体是直接RT-PCR酶混合物（Direct RT-PCR enzyme mix) 的形式，即包含有反转录酶和Taq DNA聚合酶的混合物，可以直接用于RT-PCR反应中。
[0014] 作为本发明的优选方案，所述试剂盒还包括PCR增强剂；优选地，所述PCR增强剂 选自肉碱（L-carnitine)、海藻糖（D_(+)-trehalose)和非离子去污剂NP-40中的一种或多 种。
[0015] 作为本发明的优选方案，所述试剂盒的检测对象为咽喉拭子液、泄殖腔拭子液、组 织渗出液或尿囊液。
[0016] 根据本发明的第四方面，本发明提供第一方面所述的引物在制备流感病毒A型、B 型的RT-PCR联合检测试剂盒中的应用。
[0017] 根据本发明的第四方面，本发明还提供第二方面所述的探针在制备流感病毒A 型、B型的RT-PCR联合检测试剂盒中的应用。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0019] 本发明提供的流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测引物和探针，能够用于流感 病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测方法，在该方法中，直接将液体样本加入反应体系， 在一个PCR管中连续、自动实现病毒RNA的释放、反转录和荧光定量PCR检测；实现了无需 提取病毒RNA、直接从采取的样本中检测流感病毒的目的，从得到待检测样本到获得检测结 果只需要1. 5个小时。因此，有效克服了传统RT-PCR需要提取RNA的不足，减少操作步骤， 可以同时检测流感病毒A型和B型，提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染和容易降 解的问题。基于本发明引物和探针的检测方法的灵敏性不低于传统RT-PCR，甚至在低浓度 PBS或体液的情况下灵敏性高于传统RT-PCR。该检测方法能进行病毒的高通量检测，对于 快速发现流感疫情，及时制定防控措施具有重要而深远的意义。
[0020] 此外，在原始生物样本中，往往含有大量抑制PCR的物质，比如全血（或血清、血 浆）中含有大量免疫球蛋白、血红蛋白、亚铁血红素等；土壤中含有较多腐殖酸，牛奶中含 有较多乳铁蛋白等。这些物质会抑制Taq DNA聚合酶的活性，使PCR失效，为了进一步提高 效果，本发明的试剂盒可以采用一种高耐受性Taq DNA聚合酶，可以耐受这些物质的影响。
[0021] 此外，本发明的试剂盒内还可以含有多种PCR增强剂，包括但不限于肉碱 (L-carnitine)、海藻糖（D- (+) -trehalose)、非离子去污剂NP-40,它们既能提高GC含量基 因的扩增效率，又能增加反应体系对PCR抑制物质的耐受性。此外，某些抑制物质（如血红 蛋白）会造成荧光定量PCR的荧光淬灭，本发明的试剂盒可以包含PCR增强剂，能够有效降 低抑制物质的荧光淬灭效应。因此，本发明的直接扩增RT-PCR方法能使用染料法或探针 法，进行病毒RNA的实时荧光定量PCR检测。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例2中流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测方法与提 取RNA的传统RT-PCR方法检测咽拭子液样本的灵敏性比较图；
[0023] 图2为本发明实施例2中流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测方法与提 取RNA的传统RT-PCR方法检测尿囊液样本的灵敏性比较图；
[0024] 图3为本发明实施例3中流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测方法对不 同浓度咽拭子液（10?40% )的耐受能力图；
[0025] 图4为本发明实施例4中采用本发明RT-PCR检测方法检测流感病毒A型的动态 范围；
[0026] 图5为本发明实施例4中采用本发明RT-PCR检测方法检测流感病毒A型的线性 度。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施例中 所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备和试剂等，均 为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。
[0028] 以下实施例中涉及的实验材料如下：
[0029] 1.样本处理：
[0030] 咽喉拭子液、泄殖腔拭子液：在装有拭子的离心管中加入500 μ L PBS或生理盐 水，剧烈振荡30s，尽量挤出液体移到离心管中6000rpm离心20s，取上清备用。
[0031] 组织渗出液、尿囊液：取样本6000rpm离心Imin,取上清备用。
[0032] 2.试剂：
[0033] Direct RT-PCR 2 X buffer mix (包含 20 % (V/V)甘油，50mM KC1， IOmMTris-HCl (ρΗ7· 5)，I. 5mM MgCl2,0.8mM dNTPs，0.4mM 肉碱（L-carnitine)，0.5mM 海 藻糖（D-(+)_trehalose)，0.1 % (V/V)NP-40(Nonidet P-40)，lwt % BSA，0.01 % (V/V) Tween-20，lU/yL RNA 酶抑制剂（RNase Inhibitor)，其余为去离子水）；Direct RT-PCR enzyme mix (2. 5U/ μ L Taq DNA聚合酶与5U/ μ L反转录酶按2:1体积比混合而得）；病毒 RNA柱提试剂盒。
[0034] 3.仪器：荧光定量 PCR 仪（ABI7500)，冷冻离心机（5804R，Eppendorf)。
[0035] 实施例1流感病毒A型和B型的RT-PCR检测方法（直接扩增RT-PCR方法）
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