用于产生具有物种间、靶标内交叉反应性之抗体分子的方法
【专利说明】用于产生具有物种间、靶标内交叉反应性之抗体分子的方 法
[0001] 发明背景
[0002] 1.技术领域
[0003] 本发明一般性涉及采用抗体链改组来产生具有物种间、靶标内交叉反应性之抗体 的方法。
[0004] 2.相关领域描述
[0005]用于设计和产生抗体，特别是单克隆抗体的技术在本领域中已有描述。可以将单 克隆抗体设计成选择性地与特定抗原结合。这样的抗体可用于利用抗体的结合亲和力和选 择性的诊断和/或治疗方法中。
[0006] Dreier等的美国专利申请公开2011/0300140公开了用于产生骆驼科动物 (camelid)来源的常规抗体的方法，所述方法包括用抗原来免疫骆驼科动物物种，例如大羊 马它（llama)。已经发现，特别是完全远交（outbred)的骆蛇科动物物种产生稳健（robust) 的免疫应答，产生靶标特异性抗体的多样性文库，所述靶标特异性抗体的特征在于对靶抗 原的高亲和力。
[0007] 此外，已经发现常规骆驼科动物抗体拥有这样的可变结构域，所述可变结构域与 人种系抗体的相应可变结构域具有出乎意料的高序列同源性。而且，骆驼科动物抗体与人 抗体具有出乎意料的高结构相似性。因此，骆驼科动物抗体需要很少的突变即可将可变结 构域的人特征升高至这样的水平，其中免疫原性的水平为可接受的低。这些很少的突变对 抗体针对靶标的亲和力具有很小的作用或没有作用。
[0008] Dreier等的美国专利申请公开2011/0165621公开了用于人源化骆驼科动物来源 的抗体的方案。
[0009] 已经开发出若干技术来模拟存在于活动物之免疫应答中的亲和力成熟。一旦将 这样的技术称为"链改组"，早就认识到链改组作为用于从抗体之重链或轻链的文库中产生 新抗体的手段，所述抗体在例如初次免疫应答中获得。可使用筛选方法来针对亲和力和选 择性对链改组方案中获得的抗体进行选择。以这样的方式，可产生具有与亲本抗体相比更 高亲和力和/或祀标选择性的抗体。参见，例如，Kang等，"Antibody redesign by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries"Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88(1991)，11120-11123。还可以将链改组用于通过表位印迹（imprinting)的抗 体人源化。
[0010] 为了在人类中的诊断和/或治疗用途，正开发大量抗体。因此，可针对这些抗体与 人抗原结合的能力来产生和筛选这样的抗体。对于这样的抗体在实验室环境中的测试，高 度期望这样的抗体还与在非人动物物种（特别是在实验室实践中常用的动物物种，例如啮 齿类动物，特别是小鼠）中存在的相应抗原结合。
[0011] 因此，需要用于产生具有物种间、靶标内交叉反应性之抗体分子的方法。
【发明内容】
[0012] 本发明通过提供用于产生具有物种间、靶标内交叉反应性之抗体分子的方法而解 决了该需求，所述方法包括以下步骤：
[0013] a.产生对来自第一物种的靶抗原具有特异性的第一免疫文库；
[0014] b.在链改组方案中组合来自所述第一免疫文库的可变区以产生第二免疫文库；
[0015] c.在所述第二免疫文库中鉴定与所述靶标抗原和来自第二物种的相应抗原反应 的抗体分子；
[0016] 其中所述第二物种不同于所述第一物种。
[0017] 在一个优选的实施方案中，第一物种是人，并且第一免疫文库是针对人抗原建立 的。在该优选的实施方案中，第二物种是非人动物，优选为常用的实验室动物，例如小鼠。
[0018] 本发明的另一个方面是具有物种间、靶标内交叉反应性的抗体分子。
[0019] 发明详述
[0020] 以下是本发明的详细描述。
[0021] 定义
[0022] 术语"抗体"、"抗原"、"靶抗原"、"特异性"、"亲和力"、"骆驼科动物物种"、"VL结构 域"、" VH结构域"、"可变结构域"、" L1"、" L2 "、" L3 "、"ΗΓ'、"H2 "、"H3 "、"框架区"、"恒定结 构域"和"高变环"以及本文中使用的其他特定术语如在Dreier等的美国专利申请公开号 2011/0300140中所定义，所述专利的公开内容通过引用并入本文。术语"抗体分子"是指与 靶抗原免疫反应和/或表现出与靶抗原特异性结合的包含VH结构域和VL结构域的任何多 肽。实例包括抗体、免疫球蛋白和抗体片段。
[0023] 本文使用的术语"免疫文库"是指抗体分子的集合。可通过合适的载体（例如噬菌 体、质粒或菌粒载体）来展示抗体分子。在J. Brichta等，Vet. Med.-Czech，50, 2005 (6): 231-252中综述了用于建立免疫文库的技术，其公开内容通过引用并入本文。
[0024] 本文使用的术语"链改组"是指这样的技术，其用于通过提供来自文库的抗体片 段来增加抗体文库的多样性；在展示工具（例如噬菌体展示）中表达所述片段；以及将所 表达的片段重组到抗体分子中。可针对与靶抗原X的结合，针对相对缺乏的与竞争抗原 (rival antigen)Y的不期望结合，或者两者来筛选所得的抗体分子。链改组是用于产生对 靶标具有更高亲和力或者更高结合特异性或者两者之抗体的通常使用的技术。还可将链改 组用作获得自非人物种（例如小鼠）之抗体的人源化方案。在Kang等，"Antibody redesign by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries"Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991) ,11120-11123中讨论了链改组技术，其公开内容通过引用并 入本文。
[0025] 可用任何类型的抗体片段来进行链改组，所述抗体片段例如高变环、互补决定区 (CDR)、轻链可变结构域、重链可变结构域等。例如，可用一条重链来改组轻链文库，或者可 用一条轻链来改组重链文库。
[0026] 术语"交叉反应性（cross-reactivity) "通常用来描述抗体分子与抗原之间的非 特异性结合。例如，设计为与抗原X结合的抗体X还可表现出与抗原Y结合。则认为抗体X 与抗原Y交叉反应。如果抗原X和抗原Y是来自相同物种的抗原，那么这种类型的交叉反 应性可称为"靶标间、物种内"交叉反应性。术语"靶标间"是指与不同靶标的交叉反应性。 术语"物种内"是指靶标或抗原来自相同物种。这种类型的交叉反应性通常是不期望的，因 为非预期的与抗原Y结合有损于并且可干扰与抗原X的期望结合。此外，非预期的与抗原 Y结合可干扰抗原Y的正常功能，因此引起不期望的副作用。
[0027] 当设计为与第一物种的抗原X(例如人X或hX)结合的抗体还与第二物种的抗原 Y(例如鼠Y或mY)结合时存在交叉反应性的另一种形式。可将其适当地称为"靶标间、物 种间交叉反应性"。这种类型的交叉反应性可具有令人感兴趣的科学意义，并且可用于例如 表位作图但是在其他方面没有很大价值。
[0028] 当设计为与第一物种的抗原X (例如人X，或hX)结合的抗体还与第二物种的相应 抗原X (例如鼠X，或mX)结合时存在交叉反应性的又一种形式。可将其适当地标注为"物 种间、靶标内交叉反应性"。这种类型的交叉反应性有很大的实践价值，因为其允许使用第 二物种（在该实例中为小鼠）在为人治疗和/或诊断用途所开发之抗体的研宄中作为动物 模型。
[0029] 实际上，基于在靶标亲和力和特异性方面所期望的特性来筛选和选择抗体。所选 择的候选者是否具有期望的物种间、靶标内交叉反应性本质上要看运气（the luck of the draw)。迄今为止，认为不存在将这种类型的交叉反应性改造到抗体分子中的方法。
[0030] 现在已经发现可使用链改组来产生具有特异性期望之物种间、靶标内交叉反应性 的抗体分子。因此，在其最一般的范围内，本发明涉及用于产生具有物种间、靶标内交叉反 应性之抗体分子的方法，所述方法包括以下步骤：
[0031] a.建立对来自第一物种的靶抗原具有特异性的第一免疫文库；
[0032] b.在链改组方案中组合来自所述第一免疫文库的可变区以产生第二免疫文库；
[0033] c.在所述第二免疫文库中鉴定与所述靶抗原和来自第二物种的相应抗原反应的 抗体分子；
[0034] 其中所述第二物种不同于所述第一物种。
[0035] 可通过任何合适的方法来确认来自第二文库的抗体是否与靶抗原和来自第二物 种的相应抗原反应，所述任何合适的方法包括直接方法（例如结合测定），或者用于测试结 合相关功能性的间接方法。
[0036] 应理解的是，第一物种通常是产生抗体分子的物种。在许多情况下，该物种将是 人，但是原则上所述第一物种可以是将会受益于抗体分子有效性的任何物种，例如饲养和 伴侣动物等。为了本文件的目的，第一物种将假定为人，但是读者应记住这无意于进行限 制。
[0037] 可以以任何合适的方式从第一物种中获得第一免疫文库。例如，免疫文库可以是 获得自一名或更多名健康志愿者的原初文库（nalfve library);或者其可以获得自以天然 方式用靶抗原感染的供体。如果第一物种是人，则通常伦理上不可能从用靶抗原有意感染 的供体建立第一免疫文库。
[0038] 在一个替代实施方案中，第一免疫文库获得自用靶抗原所免疫之第三物种的动 物。第三物种可与第一物种相同或不同。如果第一物种是人，那么第三物种通常不同于第 一物种。例如，第三物种可以是骆驼科（Camelidae)的成员或骆驼科动物。在一个优选的 实施方案中，第三物种是大羊驼。
[0039] 已经发现，骆驼科动物特别适于产生第一免疫文库，原因很多。人靶抗原通常在骆 驼科动物中引起强大的免疫应答。此外，完全远交的骆驼科动物可容易地用于免疫；使用 完全远交的动物有助于建立高度多样性的免疫文库。如之前所报道，获得自骆驼科动物物 种的抗体的可变结构域与相应人可变结构域具有高度的序列同源性，以及高度的结构同源 性。因此，这样的抗体需要很少的突变或者不需要突变来降低其免疫原性，使得很少存在损 失对人靶标的高度亲和力的风险。
[0040] 特别地，获得自骆驼科动物的免疫文库的高多样性显著地提高了通过本发明的方 法成功建立交叉反应性的概率。
[0041] 以本领域已知的任何方法来产生和选择第一免疫文库的抗体。例如，从供体动物 收获成熟B细胞；收集并表达RNA ;针对与靶抗原的亲和力来筛选抗体片段；对所选择的抗 体进行测序和扩增。另一些方法包括使用杂交瘤技术和克隆；B细胞分选和转染等。
[0042] 第一免疫文库可具有任何合适的形式。例如，第一免疫文库可以为来自第一免疫 文库的抗体之可变区的一个或更多个噬菌体展示文库的形式。例如，这些可变区可以是轻 链和重链。
[0043] 可使用任何链改组方案来产生第二免疫文库。应理解的是，尽管所述方法的