ID NO: 13 展示了 pGBT0PEBA8-正向 PCR 引物的 DNA 序列；
[0065] SEQ ID NO: 14 展示了 pGBT0PEBA8-反向 PCR 引物的 DNA 序列；
[0066] SEQ ID NO: 15 展示了 Pdx-正向 PCR 引物的 DNA 序列；
[0067] SEQ ID NO: 16 展示了 Pdx-反向 PCR 引物的 DNA 序列；
[0068] SEQ ID NO: 17 展示了 Hyg-正向 PCR 引物的 DNA 序列；
[0069] SEQ ID NO: 18 展示了 Hyg-反向 PCR 引物的 DNA 序列；
[0070] SEQ ID NO: 19展示了 ReKu70基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0071] SEQ ID N0:20 展示了 ReKu70cDNA 的核酸序列；
[0072] SEQ ID NO:21展示了 ReKu70多肽的氨基酸序列；
[0073] SEQ ID NO:22展示了 ReKu80基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0074] SEQ ID N0:23 展示了 ReKu80cDNA 的核酸序列；
[0075] SEQ ID NO:24展示了 ReKu80多肽的氨基酸序列；
[0076] SEQ ID N0:25展示了 ReRad50基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0077] SEQ ID N0:26 展示了 ReRad50cDNA 的核酸序列；
[0078] SEQ ID NO:27展示了 ReRad50多肽的氨基酸序列；
[0079] SEQ ID N0:28展示了 ReRad51基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0080] SEQ ID NO:29 展示了 ReRad5IcDNA 的核酸序列；
[0081] SEQ ID NO:30展示了 ReRad51多肽的氨基酸序列；
[0082] SEQ ID N0:31展示了 ReRad52基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0083] SEQ ID N0:32 展示了 ReRad52cDNA 的核酸序列；
[0084] SEQ ID NO:33展示了 ReRad52多肽的氨基酸序列；
[0085] SEQ ID N0:34展示了 ReRad54a基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0086] SEQ ID N0:35 展示了 ReRad54a cDNA 的核酸序列；
[0087] SEQ ID N0:36展示了 ReRad54a多肽的氨基酸序列；
[0088] SEQ ID N0:37展示了 ReRad54b基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0089] SEQ ID N0:38 展示了 ReRad54bcDNA 的核酸序列；
[0090] SEQ ID N0:39展示了 ReRad54b多肽的氨基酸序列；
[0091] SEQ ID N0:40展示了 ReRad55基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0092] SEQ ID N0:41 展示了 ReRad55cDNA 的核酸序列；
[0093] SEQ ID NO:42展示了 ReRad55多肽的氨基酸序列；
[0094] SEQ ID N0:43展示了 ReRad57基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0095] SEQ ID N0:44 展示了 ReRad57cDNA 的核酸序列；
[0096] SEQ ID NO:45展示了 ReRad57多肽的氨基酸序列；
[0097] SEQ ID N0:46展示了 Re⑶C2基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0098] SEQ ID N0:47 展示了 ReCDC2cDNA 的核酸序列；
[0099] SEQ ID NO:48展示了 Re⑶C2多肽的氨基酸序列；
[0100] SEQ ID N0:49展示了 ReLIG4基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0101] SEQ ID N0:50 展示了 ReLIG4cDNA 的核酸序列；
[0102] SEQ ID NO:51展示了 ReLIG4多肽的氨基酸序列；
[0103] SEQ ID NO:52展示了 ReMREll基因组区的核酸序列（包含侧翼序列）；
[0104] SEQ ID NO:53 展示了 ReMREllcDNA 的核酸序列；
[0105] SEQ ID NO:54展示了 ReMREll多肽的氨基酸序列；
[0106] SEQ ID NO: 55 展示了 Ku80-正向 PCR 引物的 DNA 序列；
[0107] SEQ ID NO: 56 展示了 Ku80-反向 PCR 引物的 DNA 序列；
[0108] SEQ ID NO: 57展不了 Rasamsonia emersonii pepA基因组区和侧翼的核酸序列。
[0109] SEQ ID NO:58 展不了 Rasamsonia emersonii pepA cDNA 的核酸序列。
[0110] SEQ ID NO:59 展不了 Rasamsonia emersonii pepA 多肤的氨基酸序列。
[0111] SEQ ID NO:60展示了第一无功能的ble标记片段（缺失ble的3'末端编码序列 的最后104个碱基的PgpdA-ble序列）。
[0112] SEQ ID N0:61展示了第二无功能的ble片段（缺失ble的5'末端编码序列的开 始12个碱基的We-TtrpC序列）。SEQ ID N0:62展示了基本构建体1的序列。
[0113] SEQ ID NO:63展示了基本构建体2的序列；
[0114] SEQ ID N0:64展示了左ADEl敲除侧翼（Left ADE1K0 flank)的正向引物序列；
[0115] SEQ ID N0:65展示了左ADEl敲除侧翼的反向引物序列；
[0116] SEQ ID N0:66展示了带有50bp ADEl敲除侧翼的基本构建体1的正向引物序列；
[0117] SEQ ID NO:67展示了基本构建体1的反向引物序列；
[0118] SEQ ID N0:68展示了产生与基本构建体1的重叠的基本构建体2的正向引物序 列；
[0119] SEQ ID N0:69展示了带有50bp ADEl敲除侧翼的基本构建体2的反向引物序列；
[0120] SEQ ID NO:70展示了用于扩增右ADEl敲除侧翼的正向引物序列；
[0121] SEQ ID NO:71展示了用于扩增右ADEl敲除侧翼的反向引物序列；
[0122] SEQ ID NO: 72展示了左侧翼ADEl的PCR片段1的序列；
[0123] SEQ ID NO: 73展示了带有ADEl敲除侧翼的基本构建体1的PCR片段2的序列；
[0124] SEQ ID NO: 74展示了带有ADEl敲除侧翼的基本构建体2的PCR片段3的序列；
[0125] SEQ ID N0:75展示了左侧翼ADEl的PCR片段的序列。
[0126] 发明详沭
[0127] 在本说明书和所附权利要求书通篇中，词语"包括"、"包含"和"具有"应被解释为 包括性的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在表达可能包括未明确指出的其他要素 或整体。
[0128] 不使用数量词时表示一个或多于一个（即一个或至少一个）的客体。例如，"要素" 可表示一个要素或多于一个要素。
[0129] 根据本发明所述的方法被用于在靶位点实施重组。重组指的是核酸的分子被打断 然后被连上不同核酸分子的过程。本发明的重组过程典型地涉及人工和有目的地重组不同 核酸分子（其可来自于相同或不同生物体）以创造重组的核酸。
[0130] 术语"重组"的意思是，例如核酸序列是通过人工组合两种否则分开的序列区段 (例如通过化学合成或通过用基因工程技术处理分离的核酸）得到的。
[0131] 本发明所述的方法依赖于同源重组和位点特异性重组的结合。
[0132] "同源重组"指的是具有包含相似核苷酸序列的对应位点的核苷酸序列（即同源序 列）之间的反应，通过所述反应分子能够相互作用（重组）以形成新的、重组的核酸序列。 相似核苷酸序列的位点在本文中被分别称为"同源序列"。典型地，同源重组的频率随着同 源序列的长度的增加而增加。因此，虽然同源重组能够在不完全相同的两种核酸序列之间 发生，但随着两种序列之间的差异的增加，重组频率（或效率）下降。可使用将被结合的两 种分子的每一种上的一种同源序列以实现重组，从而产生"单交换"的重组产物。或者，两 种同源序列可被放置将被重组的两种分子的每一种上。供体上的两种同源序列和靶标上的 两种同源序列之间的重组产生"双交换"的重组产物。
[0133] 如果供体分子上的同源序列的侧翼是将被操作的序列（例如感兴趣的序列），那 么与靶分子的双交换重组将产生这样的重组的产物,其中感兴趣的序列置换本来位于靶分 子上的同源序列之间的DNA序列。
[0134] "位点特异性重组"（也被称为保守的位点特异性重组）是核酸链的交换发生在仅 具有有限程度的序列同源性的区段之间的一类重组。位点特异性重组酶识别和结合短DNA 序列（位点），在此处切割DNA骨架、交换参与的两种DNA螺旋并重新连接DNA链，从而使核 酸区段重新排列。在一些位点特异性重组系统中，仅仅具有重组酶连同重组位点就足以执 行所有这些反应；在另一些系统中，可能还需要一些辅助蛋白和辅助位点。
[0135] 所述方法可被用于在靶位点实施重组以导致靶位点的修饰。因此，本发明可被用 于添加、缺失或以另外的方式改变靶位点。靶位点可以是编码序列或非编码序列。可利用本 发明所述的方法以使这种编码或非编码序列可被破坏和/或部分或完全缺失和/或置换。 因此，本发明所述的方法可被用于置换靶位点的序列，例如用编码标记的序列。
[0136] 典型地，在宿主细胞（例如微生物的细胞）体内实施本发明。优选地，宿主细胞可 产生感兴趣的化合物。所述宿主细胞可以在应用本发明所述的方法之前能够产生感兴趣的 化合物。在这种情况下，本发明所述的方法可被用于修饰靶位点以使所述宿主细胞的感兴 趣的化合物的生产改变，例如可以增加产量。或者，所述宿主细胞可以由于应用本发明所述 的方法而产生感兴趣的化合物。
[0137] 因此，本发明可被用于，例如最优化宿主细胞的生产力和/或使用它们的工艺。或 者，本发明可被用以，例如引入新的核酸以使宿主细胞能够产生感兴趣的新化合物。本发明 可被连续使用以引入多个新的核酸序列至宿主细胞，从而引入全新的通路或代谢通路。
[0138] 靶位点可以是待修饰的任何核酸序列。典型地，靶位点可以是基因组（生物体的 完整遗传物质）内的序列，例如染色体上的位点。这种染色体可以是线型或环形的染色体。 然而，靶位点可以在染色体外，例如质粒、微型染色体或人工染色体上的位点。靶位点可以 位于质粒、噬菌体或任何其它能够在体外或在宿主细胞中复制或者被复制的核酸序列。
[0139] 本发明所述的方法可以在体外、离体或体内实施。
[0140] 本发明所述的方法包括：
[0141] -提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点的侧翼序列同源重组 的序列；(b)两个或多个位点特异性重组位点；（c)编码识别位点特异性重组位点的重组酶 的序列；和（d)编码标记的序列，
[0142] 其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组以产生单一核酸，和
[0143] 其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记的序列； 和
[0144] -使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点 插入编码有功能标记的连续核酸序列和编码重组酶的序列，所述编码标记和/或编码重组 酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是 能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。
[0145] 本发明中，两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记的序 列。也就是说，编码标记的序列在两种或更多种核酸中的至少两种之间分开。因此，该方法 可被称为分开标记法（split-marker approach)。
[0146] 可以在体内实施位点特异性重组位点之间的核酸序列（例如标记）的外重组 (out-recombination)〇
[0147] 在本发明的方法中，体内重组可以在任何合适的宿主细胞中进行，例如在原核细 胞或真核细胞中进行。
[0148] 本发明所述的方法中，在体内实施核酸之间的相互重组以及与靶位点的重组。
[0149] 本发明所述的方法中，提供两种或更多种核酸。所述两种或更多种核酸总共提供： (a)能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或多个位点特异性重组位点；（c) 编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列；和（d)编码标记的序列。
[0150] 这并不意味着两种或更多种核酸中的每一种都包含（a)、(b)、（c)和（d)中所描述 的序列。而是，两种或更多种核酸被总合在一起成为组时，这些核酸必须包含（a)、(b)、（c) 和⑷中所描述的序列。因此，一种核酸可包含（a)、（b)、（c)和（d)中所描述的一种或更 多种序列，第二种核酸可包含（a)、(b)、（c)和（d)中所描述的另一些序列。典型地，两种或 更多种核酸中的每一种都将包含（a)、（b)、（c)和（d)中所描述的至少一种序列。然而，也 可以提供不包含（a)、（b)、（c)或⑷中所描述的至少一种序列的额外核酸。
[0151] 图6展示了所述方法的一种方式，其中使用两种核酸，但技术人员将很容易想到 更多的方式。所述方法中使用的核酸的数目可以是2、3、4、5、6或更多。
[0152] 典型地，编码标记的序列在两种核酸序列之间分开（这两种核酸序列中的每一种 都编码无功能的部分标记，但当二者被重组时将编码有功能标记）。然而，编码标记的序列 可被分开为3种、4种或更多种核酸序列。
[0153] 当编码标记的序列在两种核酸序列之间分开时，典型地这两种序列中的每一种都 还可以包含位点特异性重组位点。图6中展示了这种方法。或者,位点特异性重组位点可 由能够与包含编码标记的序列的核酸序列重组的额外核酸序列提供。
[0154] 在本发明所述的方法中，两种或更多种核酸能够相互同源重组以产生单一核酸。 由于能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列的存在，核酸在靶位点被合并成为单一连续 序列。此外，两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记的序列。
[0155] 因此，在本发明的方法中，两种或更多种核酸相互重组并与靶位点的侧翼序列重 组。以这种方式，编码有功能标记的连续核酸序列可与编码重组酶的序列和至少两个位点 特异性重组位点一起被插入至靶位点。这种编码有功能标记的序列典型地被插入在靶位点 以使其侧翼是至少两个位点特异性重组位点。当重组酶表达时，位于位点特异性重组位点 之间的序列可被外重组（out-recombined)。如果编码标记和/或编码重组酶的序列位于位 点特异性重组位点之间，那么它/它们将被外重组。然而，如果编码标记和/或编码重组酶 的序列位于位点特异性重组位点之外，那么其将被保留在靶位点。
[0156] 当重组发生后，位点特异性重组位点、标记和重组酶序列的侧翼将会是能够与靶 位点的侧翼序列同源重组的序列。
[0157] 还可以通过单独加入重组酶实施本发明所述的方法，使用例如质粒（包含编码重 组酶的序列），或者通过使用直接加入的重组酶蛋白。
[0158] 可实施本发明所述的方法以同时靶向多于1个（例如2、3、4、5或更多个）靶位点。 以这种方式，所述的两种或更多种核酸总共包含能够与两个或多个靶位点的侧翼序列同源 重组的序列。以这种方式，所述的两种或更多种核酸相互重组并与靶位点的侧翼序列重组， 从而导致每个靶位点至少插入两个位点特异性重组位点。所提供的两种或更多种核酸使得 编码有功能重组酶的核酸序列被插入在至少一个靶位点，任选地，所述靶位点位于至少两 个位点特异性重组位点之间。其它靶位点不必须地包含编码有功能重组酶的序列，但每个 靶位点将包含至少两个位点特异性重组位点（可被重组酶靶向）。至少提供两种各包含编 码无功能标记的序列的核酸。因此，一种或更多种编码有功能标记的序列可被插入在一个 或多个靶位点。但也可实施本发明所述的方法以在所有或一些靶位点插入编码有功能标记 的序列。
[0159] 再次，在每个靶位点，所述的位点特异性重组位点以及任何编码标记和编码重组 酶的序列的侧翼都将是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。
[0160] 本发明的方法中，所述的两种或更多种核酸能够相互重组以产生单一核酸。由于 能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列的存在，核酸在靶位点被合并成为单一连续的序 列。
[0161] 更详细地，本发明所提供的两种或更多种核酸总共包含能够同源重组针对靶位点 的两个或多个同源重组位点的序列。典型地当所述方法靶向单一的靶位点时，所述的两种 或更多种核酸将提供两种这样的序列。这些序列被提供以使包含至少两种或更多种核酸的 连续核酸序列（当被相互重组时）通过与靶序列侧翼的基本同源的序列重组而被插入在靶 位点。
[0162] 为了通过双交换事件实现同源重组，需要这些侧翼序列出现在通过所述的两种或 更多种核酸的重组得到的连续序列的两侧/端且与靶位点两侧的序列基本同源，这对技术 人员而言是显而易见的，因此，能够同源重组的序列典型地被提供以使它们位于通过所述 的两种或更多种核酸的重组得到的核酸序列的"5' "和"3' "末端。
[0163] 此外，根据本发明所提供的至少两种核酸能够相互重组。因此，核酸的末端被方便 地设计以使相互重组能够发生且核酸将以期望的方向和顺序被组装。因此，所提供的核酸 的末端序列将与想要与之重组的核酸的末端序列基本同源。
[0164] 本发明所使用的术语"基本同源"的意思是：第一个核酸序列与想要与之重组的第 二个核酸序列在不多于约3kb，优选地不多于约2kb，更优选地不多于约lkb，甚至更优选地 不多于约〇. 5kb，甚至更优选地不多于约0. 2kb，甚至更优选地不多于约0,1kb,如不多于约 0. 05kb，例如不多于约0. 03kb的区域中的同一性程度为至少约70%，至少约80%，优选地 至少约90 %，至少95 %，至少98 %，至少99 %，最优选地100 %。在丝状真菌中，最佳大小可 从约500bp至约2. 5kb。因此，所需的同一性程度可取决于基本同源序列的长度。同源序列