们的核 酸分子的复制、分离或遗传性；（13)核酸区段，其编码条件性复制功能（例如在某些宿主或 宿主细胞株中或者在某些环境条件（例如温度、营养条件等）下复制）；和/或编码必需基 因的核酸区段。
[0218] 在丝状真菌细胞中使用的可选择标记可选自下述组，该组包括但不限于amdS (乙 酰胺酶）、argB (鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar (草丁膦乙酰转移酶）、WeA (腐草霉素结 合）、hygB (潮霉素磷酸转移酶）、niaD (硝酸还原酶）、pyrG (乳清苷-5' -磷酸脱羧酶）、 sC (硫酸腺苷酰转移酶）、NAT或NTC (诺尔斯菌素）和trpC (邻氨基苯甲酸合酶）以及来 源于其它物种的等同物。优选的用于Aspergillus和Penicillium细胞是amdS(见例如 EP 635574 B1，EP0758020A2，EP1799821A2，W0 97/06261A2)和 A.nidulans 或 A.oryzae 的 pyrG基因和Streptomyces hygroscopicus的bar基因以及hyg和pheo-。更优选地，使用 amdS基因，甚至更优选使用来自A. nidulans或A. niger的amdS基因。最优选的可选择标 记基因是A. nidulans amdS编码序列融合至A. nidulans gpdA启动子（EP635574B1)。另一 些优选的AmdS标记是在W02006/040358中描述的标记。也可以使用来自其他丝状真菌的 AmdS 基因 （TO 97/06261)。
[0219] 本发明的方法中，体内重组可以在任何合适的宿主细胞中进行，例如在原核或真 核细胞中进行。合适的真核宿主细胞可以是哺乳动物，昆虫，植物，真菌，或藻类细胞。宿主 细胞可以是微生物或微生物宿主细胞，例如原核或真核宿主细胞。典型地，本发明的方法不 会在人或动物体内进行。
[0220] 典型地，根据本发明的方法所用的宿主细胞可以是适合感兴趣的化合物生产 的细胞并且宿主细胞的选择可以根据这样的用途进行。例如，如果根据本发明在宿主 细胞中生产的感兴趣的化合物用于食品应用，宿主细胞可以选自食品等级的生物例如 Saccharomyces cerevisiae。特殊的用途包括但是不限于，食品、（动物）饲料、药物、农业 例如作物保护，和/或个人护理应用。
[0221] 本发明的方法可以用于赋予宿主细胞生产感兴趣的化合物的能力和/或修饰现 有的感兴趣的化合物生产的方式，例如提高这样的感兴趣的化合物的产量。
[0222] 适用于本发明方法的微生物宿主细胞可以是原核细胞。优选地，原核宿主 细胞是细菌细胞。术语"细菌细胞"包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物二者。合 适的细菌可以选自例如 Escherichia， Anabaena， Caulobactert， Gluconobacter， Rhodobacter， Pseudomonas， Paracoccus， Bacillus， Brevibacterium， Corynebacterium， Rhizobium(Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus 或 Streptomyces。 优选地，细菌细胞选自由 Β·subtilis，Β· amyloliquefaciens，Β·licheniformis， Β.puntis, Β. megaterium, Β. halodurans, Β.pumilus, G.oxydans, Caulobactert crescentus CB 15， Methylobacterium extorquens， Rhodobacter sphaeroides， Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Paracoccus denitrificans, E. coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus， Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti 和 Rhizobium radiobacter 组成的组。
[0223] 适合本发明使用的宿主细胞可以是真核宿主细胞。这样的真核细胞可以是哺乳 动物，昆虫，植物，真菌或藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括例如中国仓鼠卵巢（CHO)细 胞，COS细胞，293细胞，PeK：6细胞和杂交瘤。优选的昆虫细胞包括例Sf9和Sf21细胞以 及其衍生物。更优选地，真核细胞是真菌细胞，例如酵母细胞，例如Candida，Hansenula， Kluyveromyces， Pichia， Saccharomyces， Schizosaccharomyces 或 Yarrowia 菌株。 更 优选来自 Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia Iipolytica和Pichia pastoris。最优选地，真核细胞是丝状真菌细胞。
[0224] 丝状真菌包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式（由Hawksworth 等，Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi，第 8 版，1995, CAB International，University Press，Cambridge，UK定义）。丝状真菌的特征是菌丝体的壁 由甲壳质，纤维素，葡聚糖，壳聚糖，甘露聚糖和其他复杂的多糖构成。营养生长通过菌丝延 长并且碳代谢专性需氧。丝状真菌菌株包括但是不限于以下的菌株:Acremonium，Agaricu s, Aspergillus, Aureobasidiumj Chrysosporiumj Coprinusj Cryptococcus, Filibasidiumj Fusarium，Geosmithia，Humicola，Magnaporthe，Mucor，Myceliophthora，Neocallimastix， Neurosporaj Paecilomycesj Penicilliumj Piromycesj Phanerochaetej Pleurotusj Rasamso nia,Schizophyllumj Talaromycesj Thermoascusj Thermomycesj Thielaviaj Tolypocladium 和 Trichoderma。
[0225] 优选的丝状真菌细胞属于 Acremonium，Aspergillus，Chrysosporium，Mycelio phthora，Penicillium，Rasamsonia，Talaromyces，Thielavia，Fusarium 或 Trichoderma 属的物种，最优选的是 Aspergillus niger，Acremonium alabamense，Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus，Aspergillus sojae，Aspergillus fumigatus，Talaromyces emersonii，Talaromyces thermophiIusj Thermomyces lanuginosus, Thermoascus thermophilus, Thermoascus aurantiacus，Thermoascus crustaceus，Rasamsonia emersonii，Rasamsonia byssochlamyoides, Rasamsonia argillacea，Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Aspergillus oryzae,Chrysosporium lucknowense,Fusarium oxysporum,Myceliophthora thermophila，Trichoderma reesei，Thielavia terrestris 或 Penicillium chrysogenum 的物种。更优选的宿主细胞属于Aspergillus属，更优选的宿主细胞属于物种Aspergillus niger。当根据本发明的宿主细胞是Aspergillus niger宿主细胞，宿主细胞优选地是 CBS513. 88, CBS124. 903或其衍生物。更优选的宿主细胞属于Penicillium属，更优选地，宿 主细胞属于PeniciIlium chrysogenum物种。当根据本发明所述的宿主细胞是PeniciIlium chrysogenum宿主细胞时，所述宿主细胞优选地是Wisconsin 54-1255或其衍生物。更 优选的宿主细胞属于Rasamsonia属（又名Talaromyces)，更优选地，所述宿主细胞属于 Talaromyces emersonii 物种（又名 Rasamsonia emersonii) 〇
[0226] 在本发明的方法中，在Rasamsonia细胞中实施体内重组。因此，用于本发明 的细胞属于Rasamsonia(又名Talaromyces)属，更优选地宿主细胞属于Talaromyces emersonii (又名Rasamsonia emersonii)物种。当根据本发明的宿主细胞是Talaromyces emersonii (又名Rasamsonia emersonii)宿主细胞时，所述宿主细胞优选地是 TEC-142S(TEC-142的单个分离株）（CBS 124. 902)或其衍生物。
[0227] 使用嗜热或耐热的真菌细胞可以是期望的，这种情况下优选的是Humicola、 Rhizomucor、Myceliophthora、Rasamsonia， 、Talaromyces， 、Thermomyces、Thermoascus 或 Thielavia 细胞。
[0228] 优选的嗜热或耐热的真菌是 Humicola grisea var. thermoidea、Humicola lanuginosa、Myceliophthora thermophila、Papulaspora thermophilia、Rasamsonia byssochlamydoides、 Rasamsonia emersonii、 Rasamsonia argillacea、 Rasamsonia eburnean、 Rasamsonia brevistipitata、 Rasamsonia cylindrospora、 Rhizomucor pusillus、Rhizomucor miehei、Talaromyces bacillisporus、Talaromyces leycettanus、 Talaromyces thermophiIus、 Thermomyces lenuginosus、 Thermoascus crustaceus、 Thermoascus thermophiIus Thermoascus aurantiacus 和 Thielavia terrestris。
[0229] 丝状真菌的几种菌株在许多培养物保藏机构易于被公众获得，例如美国典型培 养物保藏中心（American Type Culture Collection(ATCC)),德国微生物和细胞培养物 保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)), 真菌生物多样性中心（Centraalbureau Voor Schi_elcultures(CBS))，农业研究服 务专利培养物保藏北区研究中心（Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center(NRRL))和俄罗斯莫斯科的俄罗斯科 学院的全俄微生物保藏中心（All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences)(俄文缩写-VKM、英文缩写-RCM)。本发明上下文中用到的菌株可 以是 Aspergillus niger CBS 513. 88, CBS124. 903, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, CBS205. 89, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenum CBS 455.95,P.chrysogenum Wisconsin54-1255 (ATCC28089), Penicil Iium citrinum ATCC38065,Penici11ium chrysogenum P2,Thielavia terrestris NRRL8126, Talaromyces emersonii CBS 124. 902, Acremonium chrysogenum ATCC 36225或 ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 或 ATCC 56765 或ATCC26921, Aspergillus sojae ATCCl1906,Myceliophthora thermophila Cl,Garg27K,VKM-F 3500D, Chrysosporium lucknowense Cl, Garg 27K,VKM-F3500D，ATCC44006 和其衍生物。
[0230] 真核细胞具有至少两种分别的、通过其核酸（尤其是DNA)可被整合至宿主基因 组的途径（一种通过同源重组（HR)，一种通过非同源重组（NHR))。酵母Saccharomyces cerevisiae是优先同源重组（HR)的生物。这种生物中非同源重组相对于同源重组（NHR/ HR)的比率可在约0. 07-0. 007之间变化。
[0231] WO 02/052026公开了具有提高的DNA序列进入其基因组的靶向效率的 S. cerevisiae的突变体。这种突变体菌株缺少参与NHR的基因（KU70)。
[0232] 与S. cerevisiae相反，大部分更高等的真核生物（例如丝状真菌细胞至哺乳动物 细胞）优先NHR。在丝状真菌中，NHR/HR的比率的范围在1和大于100之间。在这种生物 体中，靶向整合频率相当低。
[0233] 因此，为了提高多核苷酸在靶位点组装的效率，优选在本发明的方法中宿主细胞 内中同源重组（HR)的效率被提高。
[0234] 因此，优选地，在根据本发明的方法中，宿主细胞优选地是诱导型增加其同源重组 (HR)的效率。由于NHR和HR路径是互联的，因此可通过调控一个或两个路径增加 HR效率。 HR组分表达的增加将提高HR的效率并且减小NHR/HR的比率。NHR组分表达的减少也将减 小NHR/HR的比率。根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞中的HR效率的增加优选地被 描述为NHR/HR的比率减小，并且优选地相对于其中HR和/或NHR路径未被调整的亲本宿 主细胞计算。HR和NHR二者的效率均可通过本领域技术人员可利用的多种方法测量。一个 优选的方法包括测定单个载体构建体在亲本和经调整的宿主细胞中靶向整合和异位整合 的效率。然后可计算两种细胞类型的NHR/HR的比率。随后，可计算NHR/HR的比率的减小。 在W02005/095624中，详细描述了该方法。
[0235] 可以通过提高HR路径的效率和/或通过降低NHR路径的效率修饰亲本真核细胞 以获得较之亲本细胞具有降低的NHR/HR的比率的宿主细胞。优选地，NHR/HR的比率因而 减小至少2倍，优选地至少4倍，更优选地至少10倍。优选地，根据本发明的载体-宿主系 统的宿主细胞中的NHR/HR的比率比亲本宿主细胞降低至少5 %，更优选地至少10 %，甚至 更优选地至少20 %，甚至更优选地至少30 %，甚至更优选地至少40 %，甚至更优选地至少 50 %，甚至更优选地至少60 %，甚至更优选地至少70 %，甚至更优选地至少80 %，甚至更优 选地至少90 %和最优选地至少100%。
[0236] 根据一个实施方式，通过提高HR组分的表达水平降低NHR/HR的比率。HR组分是 本领域技术人员公知的。HR组分在本文被定义为：参与控制靶向整合多核苷酸进入宿主的 基因组的所有基因和元件，所述多核苷酸与靶向整合的宿主基因组的某预定位点具有一定 的同源性。
[0237] 可通过降低NHR组分的表达水平减小NHR/HR的比率。NHR组分在本文被定义 为：参与控制多核苷酸整合进入宿主基因组的所有基因和元件，而不管所述多核苷酸与宿 主基因组序列的同源性程度。NHR组分对本领域的技术人员是公知的。对于根据本发明 的载体-宿主系统的宿主细胞，优选的NHR组分是选自参与NHR路径的酵母基因的同源物 或直系同源物（ortholog)的组分：KU70、KU80、RAD50、MREll、XRS2、LIG4、LIFl、NEJl 和 SIR4(van den Bosch et al·, 2002, Biol. Chem. 383:873-892 和 Allen et al·,2003, Mol. Cancer Res. 1:913-920)。最优选的是 KU70、KU80 和 LIG4 之一以及 KU70 和 KU80 二者。可 使用本领域技术人员公知的方法实现NHR组分表达水平的降低。
[0238] 因为有可能降低参与NHR的组分的表达可导致不利的表型效果，所以优选地在根 据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞中，同源重组效率的提高是诱导型的。这可通过本 领域技术人员已知的方法来实现，例如通过使用NHR组分的诱导型方法（例如通过将NHR 组分置于诱导型启动子之后）或通过使用NHR组分的瞬时破坏或通过将编码NHR组分的基 因放置回基因组。
[0239] 优选地，当根据本发明的方法使用的宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，已经在基 因组中进行了导致至少一种非核糖体肽合酶（优选根据本发明的非核糖体肽合酶，更优选 非核糖体肽合酶npsE (见国际专利申请号W02012/001169)的产生缺陷的本发明微生物宿 主细胞另外地在其基因组中包含编码选自以下的产物的多核苷酸的一种或更多种修饰，以 使宿主细胞中至少一种由包含所述修饰的多核苷酸编码的产物缺陷：葡糖淀粉酶（glaA)、 酸稳定α -淀粉酶（amyA)、中性α -淀粉酶（amyBI和amyBII)、草酸水解酶（oahA)、毒素， 优选赭曲霉素和/或伏马毒素，和蛋白酶转录调控子prtT。
[0240] 因此，真菌宿主细胞额外地包含基因组的修饰，使得葡糖淀粉酶（glaA)、酸稳定 α -淀粉酶（amyA)、中性α -淀粉酶（amyBI和amyBII)