协同引物、探针及其应用

协同引物、探针及其应用
【专利说明】协同引物、探针及其应用
[0001] 相关申请案的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年7月17日提交的美国临时申请No. 61/672,329和2012年12 月3日提交的美国临时申请No. 61/732, 537的权益，这两件临时申请据此以引用的方式整 体并入本文。 发明领域
[0003] 所公开的发明通常整体上属于核酸扩增领域。
[0004] 发明背景
[0005] 核酸试验常常需要扩增核酸获得足够浓度和/或纯度，以进行后续实验。有时核 酸扩增在非核酸，例如蛋白质的检测中用作替代法。大部分核酸扩增/延伸反应取决于3' 末端，由允许在聚合酶的存在下延伸的经修饰或天然核酸构成的引物的存在。
[0006] 这种扩增反应的普遍问题是引物-二聚体的存在。当引物延伸时，相互而非与靶 核酸，形成引物-二聚体。引物-二聚体用尽引物，导致反应中存在杂质。更糟糕的是，有 时引物-二聚体可用尽足够引物而产生假阴性。或者，如果与探针相互作用，引物-二聚体 可产生假阳性。
[0007] 已经开发了多种热起动以处理引物-二聚体的问题，包括使聚合酶悬浮于蜡材料 中，用抗体抑制聚合酶，化学改性饰聚合酶，隔绝引物和多种其它方法。关于所有这些方法 的问题是，它们只有在第一轮扩增/延伸之前有效。此后形成的任何引物-二聚体均以指 数速率扩增。
[0008] 处理引物-二聚体的其它方法包括例如巢式PCR的方法。然而，这需要两个单独 的反应并且增加了污染的机会。
[0009] 许多扩增/延伸反应也与检测探针相联系。原理往往围绕着标记线性探针例如 Taqman或标记发夹型探针例如分子信标（Molecular Beacon)。一些方法通过使用协同连 接两个探针，例如触须探针（Tentacle Probe)，实现了难以置信的特异性。然而，这些基于 探针的方法的每一种均在野生型高本底下，在检测突变体上受限。虽然它们可实现单核苷 酸多态性和其它突变的全部检测或不可实现检测，但是它们在10-20个野生型序列的本底 下只可挑选出约1个突变体。这是因为引物扩增了野生型和突变体并且耗尽，不能够检测 二者。如ARMS的方法可与探针检测技术结合以在一定程度上客服这个问题，但是当同一通 用区域中出现一个以上突变时，不能有效多重于实时检测。
[0010] 已经开发了包括检测机制的若干种引物，例如Amplifluor引物、Rapid Detex引 物和Scorpion引物。前两种特别倾向于出于引物-二聚体问题的假阳性，因为它们无序列 特异性。后者为自我探测引物，其中探针与引物延伸产物而非核酸模板结合。因为它具有 序列特异性探针，所以不大可能导致假阳性，但是仍存在引物-二聚体相关问题。
[0011] 发明概述
[0012] 本文公开了一种协同核酸分子，其包含：a)第一核酸序列，其中所述第一核酸序 列基本上与靶核酸的第一区域互补，并且其中所述第一核酸在3'末端可延伸；b)第二核酸 序列，其中所述第二核酸序列基本上与所述靶核酸的第二区域互补；其中所述第一核酸序 列和第二核酸序列相互连接；并且其中所述第二核酸序列与所述第一核酸序列3'末端下 游的所述靶核酸序列杂交；
[0013] 进一步公开了一种扩增靶核酸的方法，所述方法包括：a)提供如本文所公开的协 同核酸分子；b)提供靶核酸；和c)在用于扩增的适当条件下扩增所述靶核酸；从而扩增所 述靶核酸。
[0014] 还公开了一种检测样品中的核酸的方法，所述方法包括：a)提供如本文所公开的 协同核酸分子；其中所述协同核酸包含可检标记；b)提供靶核酸；和c)检测所述靶核酸； 从而检测所述靶核酸。
[0015] 附图简述
[0016] 图1示出协同引物的一个实施方案，其具有在引物内部，连接到捕获序列5'末端 的接头。捕获序列与靶核酸结合，并且杂交的捕获序列保持引物靠近靶标。然后引物延伸， 裂解捕获序列。
[0017] 图2示出协同引物的另一实施方案，其具有连接引物5'末端与捕获序列3'末端 的接头。捕获序列与靶核酸结合。杂交的捕获序列保持引物靠近靶标。然后引物延伸，裂 解捕获序列。
[0018] 图3示出协同引物的一个优选实施方案，捕获序列5'末端与引物5'末端连接。捕 获序列与靶核酸结合。杂交的捕获序列保持引物靠近靶标。然后引物延伸，裂解捕获序列。
[0019] 图4示出可与引物连接的探针的实例，包括但不限于双标记探针、发夹型探针和 单标记探针。
[0020] 图5示出使用与双标记探针连接的协同引物，检测核酸延伸的一个优选实施方 案。探针与靶核酸结合，并且杂交的探针保持引物靠近靶标。引物延伸，裂解探针，引起荧 光增加。
[0021] 图6示出协同引物和正常引物的凝胶。即使在没有掺入P-D时，正常引物也有一 些引物-二聚体（P-D)形成，然而，仍具有起始60个拷贝的疟原虫DNA扩增。当掺入600 个P-D时，超越疟原虫扩增产物并且仅扩增P-D。相比之下，即使掺入多达600, 000个P-D 时，协同引物也没有引物-二聚体扩增。P-D不干扰靶核酸的协同引物扩增。
[0022] 图7示出具有可用于协同引物的内置检测机制的引物的一些实例。
[0023] 图8示出具有整合探针的协同引物。标记协同引物或正常杂交探针用于 5, 000, 000、50, 000、500或0个拷贝恶性疟原虫（P. falciparum)模板的实时检测。即使捕 获序列的Tm低于反应温度，但协同引物中标记的捕获序列具有比正常杂交探针高2. 5x的 焚光信号。
[0024] 图9示出用协同引物的SNP区分。协同引物使用基于探针的区分，用捕获序列下 的SNP(9A)和使用基于ARMS的方法，用引物3'末端下的SNP(9B)，将具有产生利福平抗性 的rpoB D516V SNP和没有SNP的结核复合群区分开。
[0025] 发明详述
[0026] 所公开的方法利用允许扩增核酸序列和全基因组或其它高度复杂的核酸样品的 某些材料和程序。下面详细地描述了这些材料和程序。
[0027] 定义
[0028] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域中普通技术 人员通常所理解的相同含义。下列定义补充了本领域中的定义并且针对当前申请而不得转 嫁于任何相关或不相关的情况，例如任何共有专利或申请。虽然与本文所述相似或等效的 任何方法和材料在实践中可用于试验本发明，但是本文描述了优选材料和方法。相应地，本 文使用的术语是仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而非旨在限制。
[0029] 如本文所述，"核酸序列"指沿着核酸链，核苷酸的次序或顺序。一些情况下，这些 核苷酸的次序可决定沿着相应多肽链，氨基酸的次序。因此核酸序列编码氨基酸序列。核酸 序列可为单链或双链，按照说明，或含有双链和单链序列的一部分。核酸序列可由DNA(基 因组和cDNA)、RNA或杂种构成，其中所述序列包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组 合和碱基的任何组合，包括尿嘧啶（U)、腺嘌呤（A)、胸腺嘧啶（T)、胞嘧啶（C)、鸟嘌呤（G)、 肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。其可能包括经修饰的碱基，包括锁核酸、肽 核酸和本领域中技术人员已知的其他核酸。
[0030] "寡核苷酸"为包含两个或更多个核苷酸的聚合物。所述聚合物可另外包含非核苷 酸元件，例如标记、淬灭剂、阻断基等。寡核苷酸的核苷酸可为天然或非天然的并且可未取 代、未修饰、经取代或经修饰。核苷酸可通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯 键、硼烷磷酸酯键等连接。
[0031] "肽核酸" (PNA)为包含两个或多个肽核酸单体的聚合物。所述聚合物可另外包含 例如标记、淬灭剂、阻断基等元件。PNA的单体可未取代、未修饰、经取代或经修饰。
[0032] 所谓"协同核酸"是指最低限度地并入第一核酸序列和第二核酸序列的核酸序列， 其中所述第二核酸序列与所述第一核酸序列3'末端下游的靶核酸杂交。如本文其它地方 所讨论那样，核酸的3'末端可延伸。在一个实例中，第一核酸为引物，而第二核酸为捕获序 列。例如，第一核酸序列和第二核酸序列可由接头分隔开。
[0033] "引物"为含有与模板核酸链的一个区域互补的序列并且起动与模板（或其一部 分）互补的链合成的核酸。引物通常但不一定是相对较短、化学合成的寡核苷酸（通常为 脱氧核糖核苷酸）。在扩增，例如PCR扩增中，一对引物通常限定了扩增的核酸靶标两条互 补链的5'末端。用"协同引物"或第一核酸序列意指经由接头与也称为捕获序列的第二核 酸序列连接的引物。第二核酸序列或捕获序列可与引物或第一核酸序列3'末端下游的模 板核酸杂交。用"正常引物"意指没有捕获序列或第二核酸序列经由接头与之连接的引物。
[0034] 用"捕获序列"，本文也称为"第二核酸序列"，意指与靶核酸杂交并且使第一核酸 序列或引物序列靠近靶核酸的靶区的序列。
[0035] "下游"是相对于核酸合成或延伸期间聚合酶的作用而言。例如，当Taq聚合酶延 伸引物时，其向引物的3'末端添加碱基并将朝着"引物3'末端下游"的序列移动。
[0036] "靶区"是靶核酸的待扩增、待检测或待进行两者的区域。
[0037] 指定条件下核酸双链体的"Tm"（解链温度）为一半核酸序列解离而一半缔合的温 度。如本文所使用，"独立Tm"指协同核酸中第一或第二核酸序列在未呈协同配对时的单独 解链温度。"有效Tm"指第一或第二核酸连接在一起时所得的解链温度。
[0038] 术语"接头"意为将第一和第二核酸相互连接的组合物。接头包含至少一个不可 延伸部分，但是也可能包含可延伸核酸，并且可为任何长度。接头可连接到3'末端、5'末 端，或可连接来自第一核酸序列和第二核酸序列末端（"中间"）的一个或多个碱基。连接 可为共价、氢键合、离子相互作用、疏水性相互作用等。术语"不可延伸"和天然Taq聚合酶 不能识别某一部分，从而不能继续核酸合成有关。各种天然和经修饰的核酸碱基受聚合酶 识别并且"可延伸"。其中，不可延伸部分的实例包括荧光团、淬灭剂、聚乙二醇、聚丙二醇、 聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚醋和本领域中技术人员已知的其它部分。一些情况下，即使具有 反方向（例如5' ACGT 3' 3' A 5' 5' AAGT 3'）或其它致使Taq聚合酶不能通过其延伸的 核酸碱基，也可视为"不可延伸"。如本文所使用的术语"非核酸接头"指能够将第一核酸共 价连接到第二核酸，或更具体地，将引物共价连接到捕获序列的反应性化学基团。适合的柔 性接头通常为链中至少一个或两个原子的线性分子，更通常为长度1-12个碳原子（和/或 其它骨架原子）的有机聚合物链。示例性柔性接头包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙 烯、聚酰胺、聚酯等。
[0039] 如本文所使用，"互补"或"互补性"指多聚核苷酸分子中的核苷酸与第二多聚核 苷酸分子中的核苷酸形成碱基对的能力。例如，序列5'-A-C-T-3'与序列3'-T-G-A-5'互 补。互补性可能是局部的，其中仅一些核苷酸根据碱基配对匹配，或完全的，其中所有核苷 酸根据碱基配对匹配。为了本发明的目的，"基本上互补"指在靶碱基对区域的长度上，90% 或更高的同一性。互补性也可为 50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 %互补，或低于这些量或之间的任何量。
[0040] 如本文所使用，"扩增"指产生靶DNA的一个或多个相同或互补拷贝。所述拷贝可 为单链或双链。扩增可为多项工序的一部分，例如引物延伸、反转录、聚合酶链式反应、核酸 测序、滚环扩增等。
[0041] 如本文所使用，"经纯化"指已经将多聚核苷酸，例如靶核酸序列与细胞碎片，例如 高分子量DNA、RNA和蛋白质分