高浓度干细胞的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于制备高浓度干细胞的方法，更特定而言，涉及一种以足以用 于临床应用的高收率来培育干细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞是指不仅具有自我复制能力还具有分化成至少两种类型的细胞的能力的 细胞，且能够划分为全能干细胞、亚全能干细胞（pluripotent stem cell)和多能干细胞 (multipotent stem cell)。全能干细胞是具有能够发育成一个完整个体的全能性质的细 胞，而这些性质为卵母细胞和精子受精之后直到八细胞期的细胞所拥有。当这些细胞分离 并移植到子宫内时，它们可发育成一个完整的个体。亚全能干细胞，即能够发育成外胚层、 中胚层和内胚层来源的各种细胞和组织的细胞，来源于位于受精4-5天后生成的胚囊内部 的内细胞群。这些细胞被称为"胚胎干细胞"，能够分化成各种其他组织细胞，但不能形成 新的活有机体。多能干细胞，即仅能够分化成特异于包含这些细胞的组织和器官的细胞的 干细胞，不仅涉及胎儿期、新生儿期和成体期的各种组织和器官的生长和发育，还涉及成体 组织的稳态的维持和组织损伤后诱发再生的功能。组织特异性多能细胞统称为"成体干细 胞"。
[0003] 成体干细胞通过从各种人器官中取得细胞并使该细胞发育成干细胞而获得，并且 特征在于它们分化成仅特异性的组织。然而，近来，用于使成体干细胞分化成包括肝细胞的 各种组织的试验取得巨大成功，这成为了热点。特定而言，在再生医学领域中已经做出努 力，所述再生医学通过使用细胞来再生生物组织和器官，并恢复它们由于疾病或事故等导 致丧失的功能。在再生医学领域中经常使用的方法包括以下步骤：从患者采集干细胞、血 液来源的单核细胞或骨髓来源的单核细胞；通过试管培养诱导细胞的增殖和/或分化；和 通过移植将所选择的未分化的（干细胞和/或祖细胞）和/或已分化的细胞引入到患者体 内。因此，期望用细胞/组织替代疗法来替代通过药物或外科手术来治疗疾病的现有经典 方法，所述细胞/组织替代疗法是用健康细胞、组织或器官来替代受损细胞、组织或器官， 因而干细胞的用途将进一步增加。
[0004] 因此，目前正在研宄干细胞的各种功能。特定而言，由于使用间充质干细胞的细胞 疗法技术开始受到关注，故已经开发了用于改进自人体分离间充质干细胞以便适合于治疗 目的的技术（W0 2006/019357,韩国专利第0795708号和韩国专利第0818214号）。
[0005] 然而，还没有充分地研宄出以足够用于临床应用的量来增殖经分离的干细胞的方 法。
[0006] 因此，本发明者们进行了许多努力来以大的量制备干细胞，并且已经发现当在包 含基础培养基和至少两种选自下组的成分的培养基中培养干细胞时，干细胞能够在短时期 内以高浓度增殖，所述成分为：N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC)、抗坏血酸、胰岛素或胰岛素样 因子、皮质醇、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、EGF(表皮生长因子）和抗氧化剂，从而完 成了本发明。
[0007] 本【背景技术】部分揭示的上述信息仅用于增进对本发明【背景技术】的理解，因而其可 包含并未构成已为本领域普通技术人员所知的现有技术的信息。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的在于提供一种在短时期内以高浓度制备干细胞的方法。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供了一种用于制备高浓度干细胞的方法，该方法 包括在培养基中培养干细胞，所述培养基含有基础培养基；和至少两种选自下组的成 分：N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC)、抗坏血酸、胰岛素或胰岛素样因子、皮质醇、地塞米松 (dexamethasone)、bFGF (碱性成纤维细胞生长因子）、硫酸乙酰肝素、2-疏基乙醇、EGF (表 皮生长因子）和抗氧化剂。
[0010] 通过以下详细描述和所附权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加明 显O
【附图说明】
[0011] 图1是示出在每种培养基中持续4天培养获得自20、30、70和80岁成年男性的脂 肪来源的干细胞期间的细胞群倍增水平的图表。
【具体实施方式】
[0012] 除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通 技术人员通常理解相同的含义。一般而言，本文使用的命名和实验方法是公知的以及本领 域通常采用的那些。
[0013] 如本文所使用，术语"干细胞"是指不仅具有自我复制能力而且具有分化成至少两 种类型的细胞的能力的细胞。"成体干细胞"是指在发育过程之后形成胚胎的各个器官的时 期或者在成体时期出现的干细胞。
[0014] 如本文所使用，术语"间充质干细胞"是指分离自人或哺乳动物的组织的未分化干 细胞，其可来源于各种组织。特定而言，间充质干细胞可以是脐带来源的间充质干细胞、脐 带血来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、肌肉来源 的间充质干细胞、神经来源的间充质干细胞、皮肤来源的间充质干细胞、羊膜来源的间充质 干细胞和胎盘来源的间充质干细胞。从各个组织分离干细胞的技术是本领域已知的。
[0015] 如本文所使用，术语"脂肪来源的间充质干细胞"是分离自脂肪组织的未分化的成 体干细胞，在本文中也称为"脂肪来源的成体干细胞"、"脂肪干细胞"或"脂肪来源的干细 胞"。这些细胞能够通过本领域已知的任何常规方法获得。用于分离脂肪来源的间充质干 细胞的方法例如如下。即，脂肪来源的间充质干细胞可以通过以下方法来分离：（在生理盐 水中）培养通过脂肪抽吸获得的含脂肪的悬液，然后或者通过胰蛋白酶处理来采集附着到 诸如烧瓶等培养容器的干细胞层，或者使用刮刀通过刮擦直接采集悬浮在少量生理盐水中 的那些干细胞。
[0016] 如本文所使用，术语"高浓度干细胞的制备"是指干细胞的数量以高收率增殖。如 本文所使用，术语"高浓度的干细胞"也被称为"大量干细胞"。在本发明的实施例中，已证 实当在根据本发明的培养基中培养干细胞分离组织时，所获得的干细胞数量显著增加。优 选地，证实当经3-5次传代培养时，能够以I X 107-5X IO8个细胞/ml的浓度获得干细胞。 [0017] 如本文所使用，术语"传代培养"是指通过将细胞转移到新的培养皿并通过将培养 基基质用新鲜培养基替换以便长期培养健康细胞而周期性地传代一部分细胞。随着细胞数 量在培养皿的有限空间内增加，细胞由于预定时间内营养耗尽或废物积累而自然死亡。因 此，传代培养用于增加健康细胞的数量。典型地，1次传代是指通过替换一次基质（培养皿） 或细胞群体分离一次的培养物。可以使用本领域已知的任何传代培养方法而没有任何限 制，但优选进行机械或酶分离方法。
[0018] 如本文所使用，术语"机械分离"是指物理或机械地分离细胞聚集物。可以使用本 领域已知的任何机械分离方法而没有任何限制，但细胞可优选通过使用刀片、组织切块机、 针、移液、EBD(胚状体分配器，embryoid body divider)或刮刀分离。根据本发明的优选 实施方式，已证实通过使用刀片或组织切块机传代培养干细胞能够实现干细胞的大规模增 殖。
[0019] 如本文所使用，术语"酶分离"是指通过酶处理解离细胞聚集物。可以使用本领域 已知的任何酶分离方法而没有任何限制，但可优选通过用包括胶原蛋白酶I、II、III和IV 的胶原蛋白酶、Accutase、分散酶或胰蛋白酶处理来解离细胞聚集物，接着传代培养。
[0020] 可以通过各种途径，例如静脉内给药、动脉内给药或腹膜内给药，将干细胞给药到 体内。在这些给药途径当中，优选静脉内给药，因为其能够以方便且安全的方式治疗疾病而 无需外科手术操作。为了静脉内给予干细胞以安全地到达靶位点并呈现预期的治疗效果， 应当满足各种需求。首先，应当以一定的浓度或较高的浓度给予干细胞，使得干细胞在到达 靶位点后呈现预期的治疗效果。因而，大量获得被希望临床应用的干细胞很重要。此外，干 细胞应当具有适合血管内给药的尺寸，使得当血管内给药时，这些干细胞既不会降低血液 流速也不会形成血栓块。而且，干细胞在血管内给药之前应当不会破碎或聚集，并应当以单 个细胞安全到达其靶位点而即使在血管内给药之后也不会破碎或聚集。
[0021] 鉴于如上所述的若干需求，本发明意在提供临床有效的一定浓度或更高浓度的干 细胞。根据常规方法的干细胞培养物，必须进行许多次传代培养来获得干细胞的高收率，因 而花费许多人力和时间。特定而言，由于一部分传代培养必需的基质成分非常昂贵，故在经 济效率方面是不利的。然而，本发明能够以足够临床应用的高浓度制备干细胞。
[0022] -方面，本发明涉及一种制备高浓度干细胞的方法，该方法包括在含有基础培 养基和至少两种选自下组的成分的培养基中培养干细胞的步骤：N-乙酰基-L-半胱氨酸 (NAC)、抗坏血酸、胰岛素或胰岛素样因子、皮质醇、地塞米松、bFGF(碱性成纤维细胞生长因 子）、硫酸乙酰肝素、2-巯基乙醇、EGF (表皮生长因子）和抗氧化剂。
[0023] 优选地，本发明中使用的干细胞可使用成体干细胞，特别是获得自脂肪组织或诸 如毛根鞘囊肿、羊膜等上皮组织的成体干细胞。更优选地，可使用脂肪组织来源的成体干细 胞作为所述干细胞。间充质干细胞（MSC)可用作所述干细胞，特别是脂肪组织来源的间充 质干细胞可用作所述干细胞。脂肪组织或上皮组织优选源自哺乳动物，更优选源自人。在 本发明的实施例中，使用人脂肪组织来源的间充质干细胞（AdMSC)。
[0024] 本发明中使用的基础培养基是指具有本领域已知的适于干细胞培养的简单组成 的典型培养基。通常用于培养干细胞的基础培养基的实例包括MEM(最低必需培养基）、 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium) > RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium)和K_SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)。作为本发明中使用的基础培养基， 可以使用任何培养基而没有限制，只要它们在本领域使用。优选地，基础培养基可选自下 组：M199/F12 (混合物）（GIBCO)、MEM- α培养基（GIBCO)、含低浓度葡萄糖的DMEM培养基 (Welgene)、MCDB 131 培养基（Welgene)、MEM 培养基（GIBCO)、K-SFM、DMEM/F12 培养基、 PCM培养基和MSC扩增培养基（Chemicon)。特定而言，其中可优选使用K-SFM。
[0025] 用于获得经培养的间充质干细胞的基础培养基可补充本领域已知的添加剂，所述 添加剂促进处于未分化状态的间充质干细胞的增殖同时抑制其分化。并且，培养基可包含 等渗溶液中的中性缓冲液（如磷酸盐和/或高浓度碳酸氢盐），和蛋白质营养物（例如，血 清如FBS、FCS(胎牛血清，fetal calf serum)或马血清、血清替代物、白蛋白或者必需或非 必需氨基酸如谷氨酰胺或L-谷氨酰胺）。而且，其可以包含脂类（脂肪酸、胆固醇、血清的 HDL或LDL提取物）和存在于大多数这类储存介质中的其他成分（如胰岛素或转铁蛋白、核 苷或核苷酸、丙酮酸盐、诸如葡萄糖的糖源、呈任何离子化形式或盐的硒、诸如皮质醇的糖 皮质激素和/或诸如β-巯基乙醇的还原剂）。
[0026] 并且，出于防止细胞彼此粘附、粘附于容器壁或形成太大的团簇的目的，培养基可 有利地包含抗凝聚剂，如Invitrogen销售的抗凝聚剂（