Cat#0010057AE)。
[0027] 其中，可以有利地使用一种或多种以下额外的添加剂：
[0028] ?干细胞因子（SCF，青灰因子）、二聚化c-kit的其他配体或抗体以及同一信号通 路的其他激活剂
[0029] ?针对其他酪氨酸激酶相关受体的配体，如针对血小板来源的生长因子（PDGF)的 受体、巨噬细胞集落刺激因子、Flt-3配体和血管内皮细胞生长因子（VEGF)
[0030] ?升高环状AMP水平的因子，如毛喉素（forskolin)
[0031] ?诱导 gpl30 的因子，如：LIF 或制瘤素 -M(Oncostatin-M)
[0032] ?造血生长因子，如促血小板生成素（TPO)
[0033] ?转化生长因子，如TGF β 1
[0034] ?神经素营养因子（neurotrophin)，如 CNTF
[0035] ?抗生素，如庆大霉素、青霉素或链霉素。
[0036] 本发明中使用的培养基除了基础培养基之外，还可包含至少两种选自下组的成 分：N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC)、胰岛素或胰岛素样因子、皮质醇、碱性成纤维细胞生长因 子（bFGF)和抗氧化剂。
[0037] 本发明中使用的培养基可包含基础培养基和至少两种选自下组的成分：N-乙酰 基-L-半胱氨酸（NAC)、抗坏血酸、胰岛素或胰岛素样因子、皮质醇、地塞米松、bFGF(碱性成 纤维细胞生长因子）、硫酸乙酰肝素、2-巯基乙醇、EGF (表皮生长因子）和抗氧化剂。
[0038] 具体而言，培养基可包含胰岛素样因子作为胰岛素替代物，所述胰岛素样因子通 过增强葡萄糖代谢和蛋白质代谢而起到促进细胞生长的作用。特定而言，优选使用重组 IGF-I (胰岛素样生长因子-1)。胰岛素样因子的优选含量是10-50ng/ml。如果胰岛素样因 子的含量小于l〇ng/ml，将发生细胞凋亡，而如果含量高于50ng/ml，则将增加细胞毒性和 培养基成本。
[0039] 培养基可包含能够诱导各种类型的细胞体内增殖的碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)。优选地，使用重组bFGF蛋白。bFGF优选的含量为l-100ng/ml。
[0040] 本发明中可使用的抗氧化剂实例包括硒、抗坏血酸、维生素 E、儿茶酚、番茄红素、 β-胡萝卜素、辅酶Q_l〇、EPA(二十碳五烯酸）、DHA(二十碳六烯酸）等等。优选地，可以使 用硒。在本发明的实施例中，使用硒作为抗氧化剂。培养基中的硒的含量优选为0. 5-10ng/ ml。如果硒的含量小于0. 5ng/ml，则培养基将对氧毒性敏感，而如果含量高于10ng/ml，则 将造成严重的细胞毒性。
[0041] 本发明中使用的培养基可另外包含选自FBS (胎牛血清）、钙和EGF的成分。表皮 生长因子（EGF)能够诱导体内各种类型的细胞增殖，且优选使用重组EGF蛋白。表皮生长 因子的优选含量为10-50ng/ml。如果培养基中表皮生长因子的含量少于10ng/ml，将不具 有特定的效果，而如果含量高于50ng/ml，则将对细胞有毒性。
[0042] 优选地，当传代培养3-5次时，在根据本发明的培养基中培养的干细胞以 IX 107-5X IO8个细胞/ml的浓度增殖。此外，由于在通过传代培养的干细胞的数量增加 期间不发生细胞的功能/形态畸变，故根据本发明获得的干细胞能够有效地应用于临床试 验。
[0043] 在本发明的实施例中，在本发明的培养基中培养脂肪来源的间充质干细胞。能够 以以下方式获得脂肪来源的间充质干细胞。首先，通过脂肪抽吸或类似方法从腹部获得人 脂肪组织，并用PBS洗涤，之后将组织细切并使用包含胶原蛋白酶的DMEM培养基降解。将 经降解的组织用PBS洗涤并以IOOOrpm离心5分钟。去除上清液，并用PBS洗涤留在底部 的沉淀，然后以IOOOrpm离心5分钟。将得到的细胞通过100目的过滤器过滤以去除碎片， 然后用PBS洗涤。将细胞在DMEM培养基（10%FBS、2mM NAC、0. 2mM抗坏血酸）中培养过 夜，然后用PBS将没有附着到培养容器底部的细胞洗涤出去，将细胞进行传代培养，同时以 2天为间隔将培养基用含有NAC、抗坏血酸、钙、rEGF、胰岛素、Bfgf、皮质醇和硒的K-SFM培 养基替换，从而获得脂肪来源的间充质干细胞。除了该方法，也可以使用本领域已知的方法 来获得间充质干细胞。
[0044] 下面，将参考实施例进一步详细描述本发明。对本领域普通技术人员而言显然这 些实施例仅是说明目的而不构成对本发明范围的限制。
[0045] 实施例1 :人脂肪组织来源的间充质干细胞的分离
[0046] 用PBS洗涤由脂肪抽吸从腹部组织分离的脂肪组织并细切，之后于37°C下在补充 有1型胶原蛋白酶（lmg/ml)的DMEM培养基中消化所述组织2小时。用PBS洗涤经胶原蛋 白酶处理的组织并以IOOOrpm离心5分钟。去除上清液，并用PBS洗涤沉淀，然后以IOOOrpm 离心5分钟。将得到的细胞通过100目的过滤器过滤以去除碎片，之后用PBS洗涤细胞，并 在包含10% FBS、2mM NAC(N-乙酰基-L-半胱氨酸）和0. 2mM抗坏血酸的DMEM培养基中培 养过夜。
[0047] 然后，用PBS洗涤去除未附着的细胞，用包含5% FBS、2mM NAC、0. 2mM抗坏血酸、 0· OgmMUSng/ml rEGF、5 μ g/ml 胰岛素 、IOng bFGF 和 74ng/ml 皮质醇的 K-SFM(角质细胞 无血清培养基）以2天为间隔替换培养基同时将留下的细胞培养4代，从而分离脂肪来源 的间充质干细胞。
[0048] 实施例2 :培养基成分对干细胞增殖能力的效果研宄
[0049] 制备包含全部如下成分的培养基（即，培养基I) :FBS、N-乙酰基-L-半胱氨酸 (NAC)、抗坏血酸、胰岛素、皮质醇、bFGF (碱性成纤维细胞生长因子）、EGF (表皮生长因子） 和硒，上述成分是添加到实施例1中使用的K-SFM培养基中的活性成分，并制备不含至少一 种上述活性成分的培养基（即，培养基2-9)。培养基组成如下：
[0050] 培养基I (Ml) :K-SFM培养基+FBS+NAC+抗坏血酸+胰岛素+皮质醇+bFGF+EGF+ 硒
[0051] 培养基2 (M2) :K-SFM培养基+NAC+抗坏血酸+胰岛素+皮质醇+bFGF+EGF+硒（从 培养基1的成分中排除FBS)
[0052] 培养基3 (M3) :K-SFM培养基+FBS+NAC+抗坏血酸+胰岛素+皮质醇+EGF+硒（从 培养基1的成分中排除bFGF)
[0053] 培养基4 (M4) :K-SFM培养基+FBS+NAC+抗坏血酸+皮质醇+bFGF+EGF+硒（从培 养基1的成分中排除胰岛素）
[0054] 培养基5 (M5) :K-SFM培养基+FBS+NAC+抗坏血酸+胰岛素+bFGF+EGF+硒（从培 养基1的成分中排除皮质醇）
[0055] 培养基6 (M6) :K-SFM培养基+FBS+NAC+抗坏血酸+胰岛素+皮质醇+bFGF+硒（从 培养基1的成分中排除EGF)
[0056] 培养基7 (M7) :K-SFM培养基+FBS+NAC+胰岛素+皮质醇+bFGF+EGF+硒（从培养 基1的成分中排除抗坏血酸）
[0057] 培养基8 (M8) :K-SFM培养基+FBS+抗坏血酸+胰岛素+皮质醇+bFGF+EGF+硒（从 培养基1的成分中排除NAC)
[0058] 培养基9 (M9) :K-SFM培养基+FBS+NAC+抗坏血酸+胰岛素+皮质醇 +bFGF+EGF+(从培养基1的成分中排除硒）
[0059] 培养基10 (MlO) :K-SFM培养基+FBS+NAC+抗坏血酸+胰岛素+皮质醇+硒（从培 养基1的成分中排除bFGF和EGF)。
[0060] 在培养基中培养脂肪来源的干细胞。使用自20、30、70和80岁成年男性获得的脂 肪来源的干细胞作为脂肪干细胞。在每种培养基中培养传代4次后，将获得的脂肪来源的 间充质干细胞用胰蛋白酶处理，然后用共焦显微镜测量细胞数量。从下表1可见，列出了当 将I X IO5个脂肪来源的间充质干细胞以3次传代接种到培养基中并培育4天时，基于培养 基和天数获得的细胞数量。结果，根据本发明的干细胞培养方法，能够证实当培养干细胞4 天时，依赖于培养基的成分能够以2. 5 X IO6个细胞/ml的最大浓度制备干细胞（见表1)。 此外，尽管细胞群体倍增水平（CPDL)根据年龄稍有差异，但培养基9表现出最高的细胞群 体倍增水平（CPDL)。在20岁和30年龄的成年男性中，能够证实当将干细胞以I X IO5个细 胞/ml的浓度接种到培养基中并接种4天时，细胞数量增加13-25倍。在70岁和80年龄 的成年男性的情况下，同样能够证实细胞数量增加7-15倍（见图1)。此外，未证实发生突 变的细胞（未显示）。
[0061] 表 1
[0062] [表 1]
[0063] 用于高浓度干细朐制各的培养基组成的研究
[0064]
[0065；
【主权项】
1. 一种以IX10 7-5X108个细胞/ml的高浓度制备干细胞的方法，所述方法包括在 培养基中培养干细胞，所述培养基包含基础培养基；和至少两种选自下组的成分：N_乙酰 基-L-半胱氨酸（NAC)、抗坏血酸、胰岛素或胰岛素样因子、皮质醇、地塞米松、bFGF(碱性成 纤维细胞生长因子）、硫酸乙酰肝素、2-巯基乙醇、EGF(表皮生长因子）和抗氧化剂。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基选自下组：M199/F12 (混合物） (GIBCO)、MEM-a培养基（GIBC0)、含低浓度葡萄糖的DMEM培养基（Welgene)、MCDB131培 养基（Welgene)、MEM培养基（GIBC0)、K-SFM、DMEM/F12培养基、PCM培养基和MSC扩增培 养基（Chemicon) 〇
3. 权利要求1所述的方法，其中所述抗氧化剂选自下组：硒、抗坏血酸、维生素E、儿茶 酚、番茄红素、胡萝卜素、辅酶Q-KKEPA(二十碳五烯酸）和DHA(二十碳六烯酸）。
4. 权利要求3所述的方法，其中所述抗氧化剂是硒。
5. 权利要求1所述的方法，其中所述培养基另外包含选自FBS(胎牛血清）、钙和EGF 的成分。
6. 权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是脂肪组织来源的间充质干细胞。
【专利摘要】本发明涉及一种用于以高浓度制备干细胞的方法。本发明使得在短时期内以足够临床使用的量培育干细胞成为可能，并且使得相对高效地增加被给药的干细胞有效地到达靶组织并以稳定地方式起作用的能力成为可能，因而能够显著提高使用干细胞的细胞治疗的功效。
【IPC分类】C12N5-0775, C12N5-02
【公开号】CN104603263
【申请号】CN201380026928
【发明人】罗廷灿, 姜成根, 曹廷允
【申请人】K-干细胞有限公司, 罗廷灿
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2013年5月23日
【公告号】EP2865749A1, US20150118748, WO2014003319A1