使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年6月14日提交的美国临时专利申请序列号61/741，776的 权益，所述美国临时专利申请全文以引用方式并入本文用于任何目的。
技术领域
[0003] 本发明涉及处理多能细胞的方法，其中通过用GSK-3B酶活性抑制剂处理多能细 胞，可使该多能细胞在培养物中有效扩增和分化。
【背景技术】
[0004] 用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集 中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能细胞 (例如胚胎干细胞）产生功能性β细胞。
[0005] 在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三 个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的一组细胞。诸如例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之 类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段为形成定形内胚层。定 形内胚层细胞可表达多种标志物，例如HNF-3 β、GATA-4、MiX11、CXCR4和SOX-17。
[0006] 定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层的细胞可表达胰-十二 指肠同源盒基因 rox-ι。在不存在rox-i时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因此， PDX-I的表达标志着胰腺器官形成中的关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外 分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
[0007] 产生足够量的细胞物质用于移植需要可在培养物中有效扩增并有效分化成所关 注的组织（例如功能性β细胞）的细胞物质来源。
[0008] 培养人胚胎干细胞的当前方法较复杂；它们需要使用外源因子或化学成分确定的 培养基以便使细胞增殖而不丧失其多能性。此外，胚胎干细胞的分化通常导致细胞在培养 物中扩增减少。
[0009] 例如，Cheon 等人（BioR印rod DOI : 10. 1095/biolr印rod. 105. 046870,2005 年 10 月19日）公开了一种无饲养细胞的无血清培养系统，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发 胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代（SR)培养基中。
[0010] 又如，US20050233446公开了一种可用于培养干细胞的成分确定的培养基，所述干 细胞包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，该培养基与被培养的干细胞基本上等渗。 在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血 酸，所述bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行基本上非分化性生长所必需。
[0011] 又如，W02005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干 细胞暴露于转化生长因子_β (TGFP)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子（FGF)蛋白家 族的成员或烟酰胺（NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持细胞处于未分化状态达足以实 现所需结果的一段时间。
[0012] 已知糖原合成酶激酶-3(GSK-3)的抑制剂可促进成体干细胞的增殖和 扩增。在一个实例中，Tateishi 等人（Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 352 :635)表明，抑制GSK-3可增强从新生儿或成人心脏回收并具有 间质特征的人心脏干细胞（hCSC)的生长和存活。
[0013] 例如，Rulifson 等人（PNAS 144,6247-6252，（2007))声称 "Wnt 信号传导刺激胰 岛β细胞增殖"。
[0014] 又如，W02007016485报道，添加 GSK-3抑制剂至非胚胎干细胞（包括多潜能成体 祖细胞）的培养物可导致在扩增期间维持多能表型，并导致更强的分化响应。
[0015] 又如，US2006030042利用通过添加 Wnt或GSK-3酶活性的小分子抑制剂来抑制 GSK-3的方法，来在不使用饲养细胞层的情况下维持胚胎干细胞。
[0016] 又如，W02006026473报道添加 GSK-3B抑制剂，通过转录激活c-myc和稳定c-myc 蛋白来使多能细胞保持稳定。
[0017] 又如，W02006100490报道使用含有GSK-3抑制剂和gpl30激动剂的干细胞培养基 来维持多能干细胞（包括小鼠或人胚胎干细胞）的自我更新群体。
[0018] 又如，Sato等人（Nature Medicine(2004) 10 :55-63)表明，用特异性药理性化 合物抑制GSK-3可维持胚胎干细胞的未分化表型以及维持多能状态特异性转录因子例如 Oct-3/4、Rex-I 和 Nanog 的表达。
[0019] 又如，Maurer等人（Journal of Proteome Research(2007)6 :1198-1208)表明，用 GSK-3抑制剂处理成体神经元干细胞可显示出神经元分化的增强，特别是通过促进β -连 环蛋白靶基因的转录和使细胞凋亡降低。
[0020] 又如，Gregory 等人（Annals of the New York Academy of Sciences (2005) 1049 : 97-106)报道，GSK-3B的抑制剂可增强体外成骨作用。
[0021] 又如，Feng 等人（Biochemical and Biophysical Re search Communcations (2004) 324 :1333-1339)表明，胚胎干细胞向造血分化与Wnt/ β -连环蛋白 途径的下调相关，其中Wnt为GSK3的天然抑制剂。
[0022] 因此，仍然非常需要开发用于处理多能干细胞而使得多能干细胞可被扩增以满足 当前临床需要，同时保持分化为胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞 的潜能的方法。
【发明内容】
[0023] 本发明提供了通过用GSK-3B酶活性抑制剂处理多能细胞而使多能细胞扩增和分 化的方法。
[0024] 在一个实施例中，本发明提供了使多能细胞扩增和分化的方法，该方法包括以下 步骤：
[0025] a.培养多能细胞，以及
[0026] b.用GSK-3B酶活性抑制剂处理所述多能细胞。
[0027] 在一个实施例中，所述多能细胞分化成可表达定形内胚层谱系特征性标志物的细 胞。
[0028] 多能细胞可以为人胚胎干细胞，或者它们可以为根据60/913475中公开的方法衍 生自人胚胎干细胞的表达多能标志物的细胞。
[0029] 在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂为式（I)的化合物：
[0030]
【主权项】
1. 一种使多能细胞扩增和分化的方法，所述方法包括w下步骤： a. 培养多能细胞，W及 b. 用GSK-3B酶活性抑制剂处理所述多能细胞。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞为胚胎干细胞。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞为衍生自胚胎干细胞的表达多能标 志物的细胞。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述表达多能标志物的细胞表达选自下列多能标 志物中的至少一种；ABCG2、cripto、化义03、Connexin43、Connexin45、0ct4、S0X-2、Nanog、 hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1 -60 和 Tra 1 -81。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性 标志物的细胞。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中将所述多能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约1 至约72小时。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中将所述多能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约 12至约48小时。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中将所述多能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约 48小时。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂W约lOOnM至约100 y M 的浓度使用。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂W约1 y M至约10 y M 的浓度使用。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂W约10 y M的浓度使 用。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂为式（I)的化合物：
式（I)。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中R1为苯基；取代的苯基，其中所述苯基取代基选 自Ci_5焼基、团素、硝基、S氣甲基和膳；或嚼巧基。
14. 根据权利要求12所述的方法，其中R,为苯基；取代的苯基，其中所述苯基取代基选 自Ci_5焼基、团素、硝基、立氣甲基和膳；或任选地被C 1_4焼基取代的嚼巧基，并且R郝R 2中 的至少一者为嚼巧基。
15. 根据权利要求12所述的方法，其中Rs为氨；2-(H甲基甲娃焼基）己氧基甲基；Cw 焼氧基撰基；芳氧基撰基；芳基Ci_g焼氧基撰基；芳基C 焼基；取代的芳基C 焼基，其中 所述一个或多个芳基取代基独立地选自Ci_5焼基、C 1_5焼氧基、团素、氨基、C 1_5焼基氨基和 二Ci_5焼基氨基；邻苯二甲醜亚胺基C 1_5焼基；氨基C 1_5焼基；二氨基C 1_5焼基；玻巧醜亚胺 基基；C 1-5；^基M基；芳基M基；C 1-5；^基M基C 1-5；^基；矛口芳氧基M基C 1-5；^基。
16. 根据权利要求12所述的方法，其中R 4为-(A)-畑2) q-X。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中A为亚己帰基、亚己快基或
18. 根据权利要求17所述的方法，其中Rg选自氨、Cw焼基、苯基和苯基Cw焼基。
19. 根据权利要求16所述的方法，其中q为0-9。
20. 根据权利要求16所述的方法，其中X选自氨；轻基；己帰基；取代的己帰基，其中一 个或多个己帰基取代基各自选自氣、漠、氯和楓；己快基；取代的己快基，其中所述己快基 取代基选自氣、漠、氯和楓；Cw焼基；取代的Cw焼基，其中所述一个或多个焼基取代基各 自选自Cw焼氧基、H团代焼基、邻苯二甲醜亚胺基和氨基；Cs_，环焼基；Cw焼氧基；取代的 Cw焼氧基，其中所述焼基取代基选自邻苯二甲醜亚胺基和氨基；邻苯二甲醜亚胺基氧基； 苯氧基；取代的苯氧基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自Cw焼基、团素和Cw焼 氧基；苯基；取代的苯基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自Cw焼基、团素和C W焼 氧基；芳基Cw焼基；取代的芳基Cw焼基，其中所述一个或多个芳基取代基各自选自Cw焼 基、团素和Ci_g焼氧基；芳氧基Ci_g焼基氨基；Ci_g焼基氨基；二Ci_g焼基氨基；膳；巧；予氧基 亚氨基；Cw焼氧基亚氨基；邻苯二甲醜亚胺基；玻巧醜亚胺基；C W焼基撰氧基；苯基撰氧 基；取代的苯基撰氧基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自Cw焼基、团素和Cw焼 氧基；苯基Cw焼基撰氧基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自C W焼基、团素和C W 焼氧基；氨基撰氧基；Ci_g焼基氨基撰氧基；二C 焼基氨基撰氧基；C 焼氧基撰氧基；取 代的Cw焼氧基撰氧基，其中所述一个或多个焼基取代基各自选自甲基、己基、异丙基和己 基；苯氧基撰氧基；取代的苯氧基撰氧基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自Cw焼 基、Cw焼氧基和团素；C W焼硫基；取代的C W焼硫基，其中所述焼基取代基选自轻基和邻 苯二甲醜亚胺基；Cw焼基賴醜基；苯基賴醜基；取代的苯基賴醜基，其中所述一个或多个 苯基取代基各自选自漠、氣、氯、Ci_5焼氧基和二氣甲基；条件是如果A为
q为0， 并且X为H，则Rs可不为2-( H甲基甲娃焼基）己氧基甲基；W及它们药学上可接受的盐