越短，同源性百分比可越高。
[0165] 在本发明中，所述的两种或更多种核酸总共包含两个或多个位点特异性重组位 点。这些位点特异性重组位点被由两种或更多种核酸总共编码的重组酶识别。
[0166] 所述的位点特异性重组位点和重组酶被选择以使重组酶可以靶向位点特异性重 组位点，从而导致位于重组位点之间的序列被外重组。
[0167] 术语"重组酶"或"位点特异性重组酶"或其类似物指的是识别和结合至短核酸位 点或"位点特异性重组位点"（即重组酶识别位点）并催化与这些位点相关的核酸重组的酶 或重组酶。这些酶包括重组酶、转座酶和整合酶。
[0168] "位点特异性重组位点"或其类似物指的是短核酸位点或序列（即重组酶识别 位点），其被序列或位点特异性重组酶识别并在位点特异性重组事件过程中变成交换 (crossover)区域。序列特异性重组酶祀位点的实例包括但不限于Iox位点、att位点、dif 位点和frt位点。
[0169] 本文中使用的术语"lox位点"指的是一种核苷酸序列，其中噬菌体Pl的ere基 因的产物（即Cre重组酶）能够在该序列上催化位点特异性重组事件。本领域已知的多种 Iox位点，包括天然存在的1〇χΡ、1〇χΒ、IoxL和IoxR以及大量突变的或变体Iox位点，例如 1οχ66、1οχ71、1οχΡ511、1οχΡ514、1οχΛ86、ΙοχΛ 117、loxC2、1οχΡ2、1οχΡ3 和 Iox P23。
[0170] 本文中使用的术语"frt位点"指的是一种核苷酸序列，其中酵母2微米质粒的FLP 基因的产物（即FLP重组酶）能够在该序列上催化位点特异性重组。
[0171] 位点特异性重组位点可使重组酶表达后的外重组在靶位点产生不被重组酶识别 的单个突变位点特异性重组位点。特别地，所述Iox位点可以是l〇x66和lox71 (Albert, Η. , Dale, Ε. C. , Lee, Ε. , &0w, D. W. (1995)). Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant Iox sites placed in the plant genome. Plant Journal,7(4), 649-659)。在一个特定的实施方式中，lox66和lox71位点特异性重组位点可使重组酶表 达后的外重组在靶位点产生不被重组酶识别的l〇x72突变位点特异性重组位点。
[0172] 本发明所实施的方法中，除了重组酶、位点特异性重组位点和能够与靶位点的侧 翼序列同源重组的序列之外，两种或更多种核酸总共还包含编码标记的序列以使所述的两 种或更多种核酸的重组导致所述的编码标记基因的序列被插入在靶位点。这种编码标记的 序列可位于至少两种能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列之间。
[0173] 关键地，两种或更多种核酸被提供以使至少两种核酸各包含编码无功能的部分标 记编码序列的序列。当所述的两种或更多种核酸被重组时，将产生编码有功能标记的连续 序列。因此，本发明的方法被称为"分开标记"法。
[0174] 在本发明的上下文中，无功能指的是无法编码能够担当有功能选择标记的产物的 序列。
[0175] 典型地，可实施所述方法以使编码标记的序列位于两个或多个位点特异性重组位 点之间。以这种方式，标记基因可通过重组酶的表达被外重组。因此，所述方法可被用于显 性标记和反向选择标记。
[0176] 以这种方式，可以使用相同的标记以重复模式实施所述方法，其中所述重复模式 具有不止一个循环的与靶位点的侧翼序列的同源重组，然后在重组酶表达后外重组。可进 一步将这种方法与突变位点特异性重组位点的使用相结合，其中一旦标记被外重组，所述 位点就不能被重组酶靶向。
[0177] 本发明的一个优势在于：它允许同时、连续或分别实施多个重组事件。
[0178] 因此，可使用相同的标记以具有不止一个重组循环的重复模式实施所述方法。因 此，本发明特别适用于可供使用的标记集合有限的情况。可进一步将这种方法与突变位点 特异性重组位点的使用相结合，其中一旦标记被外重组，所述位点就不能被重组酶靶向。由 于标记通过重组酶的激活而被消除，因此这个方法允许靶向多个位点且被靶向的位点的数 目不受不同标记的可用性的限制。
[0179] 在本发明的方法中，两种或更多种核酸总共可包含两种或更多种不同的标记编码 序列以使所述的两种或更多种核酸的重组导致所述的两种或更多种不同的标记基因编码 序列被插入在靶位点。可提供能够与两个或多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列以实施 这种方法。进一步，可以使用一种标记靶向至少两个靶位点，使用不同的标记靶向一个或多 个其它靶位点。
[0180] 在本发明的方法中，编码标记的序列之一将是分开的。在本发明的另一个优选的 实施方式中，两种或更多种或甚至所有的编码标记的序列典型地都将是分开的。也就是说， 对于每一个标记，两种或更多种核酸被提供以使至少两种核酸各包含编码无功能的部分标 记编码序列的序列。所述的两种或更多种核酸的重组产生编码有功能标记的连续序列。本 发明所述的方法可包括至少一种分开的标记。典型地，所用的所有编码标记的序列都以分 开的形式被提供。
[0181] 可实施所述的方法以使一种或更多种相同的或不同的标记被重组至细胞，其中每 个标记的侧翼均为Iox位点。然后，本发明所述的方法可被用于提供进一步的重组事件，同 时除去所有这些标记。
[0182] 在本发明所述的方法中，靶位点可包含被破坏和/或部分或全部缺失的编码序 列。典型地，所述方法在靶位点增加新序列；这种新序列典型地将替换、缺失和/或修饰靶 位点的序列。
[0183] 如上所述，当在宿主细胞体内实施重组时，置换序列可以例如赋予可选择的表型。 在这种情况下，所述置换序列包含选择标记。优选地，实施这种方法以使标记可通过重组酶 的表达被外重组。
[0184] 置换序列还可以是靶序列的经修饰形式，例如以改变对感兴趣的序列的调控或表 达与原始基因产物相比性质改变的经修饰的基因产物。
[0185] 置换序列还可以组成已存在于宿主细胞基因组中的感兴趣的序列的额外拷贝，以 扩增所述的感兴趣的序列。
[0186] 置换序列可以相对于宿主细胞是同源的或异源的序列。其可以从任何合适的来源 获得或者可通过订制合成制备。
[0187] 靶序列可以是任何感兴趣的序列。例如，靶序列可以是利用失活或修饰该序列而 被研究其功能的序列。靶序列还可以是这样的序列，其失活、修饰或过表达是期望的以赋予 宿主细胞期望的表型。典型地，本发明所述的方法将导致靶位点的一些核酸序列被移除。然 而，本发明所述的方法可被用于在靶位点插入序列而不从靶位点丢失任何序列。
[0188] 在本公开的上下文中，术语"核酸"、"核酸序列"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核 酸片断"、"分离的核酸片段"在本文中可被交换使用。
[0189] 这些术语包括核苷酸序列及其类似物。核酸可以是单链或双链的DNA或RNA的聚 合物，任选地，其含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。
[0190] DNA聚合物形式的核酸可包括cDNA、基因组DNA或合成DNA或其混合物中的一种 或更多种区段。
[0191] 术语"分离的核酸"和其类似物指的是大体上不含其它核酸序列（例如但不限于 其它染色体的和染色体外的DNA和/或RNA)的核酸。可从分离的核酸天然存在的宿主细 胞中将其纯化。
[0192] 可使用技术人员已知的常规核酸纯化方法获得分离的核酸。该术语还包括重组 的核酸和化学合成的核酸。典型地，可利用本领域已知的任何扩增方法（例如PCR、RT-PCR 等）产生适用于本发明的两种或更多种核酸中的每一种。本文中使用的术语"扩增"或"扩 增反应"指的是用于增加核酸中靶序列拷贝的任何体外方法。有时候，扩增指的是靶核酸的 "指数"增加。然而，本文中使用的"扩增"还可以指选择的核酸靶序列的数目线性增加，但 典型地不同于一次、单引物延伸步骤。
[0193] 典型地，两种或更多种核酸被引入宿主细胞以使重组事件可发生。可使用本领域 的技术人员公知的多种技术将所述的两种或更多种核酸引入宿主细胞。被用于引入异源 的核酸至多种生物体的方法的非限制性实例包括：转化、转染、转导、电穿孔、超声介导的转 化、粒子轰击等。在某些情况下，加入载体分子能够增加典型地被认为很难通过常规方法转 化的细胞对DNA的摄取。技术人员易于得知转化的常规方法。
[0194] 用于产生两种或更多种核酸以及之后将它们引入宿主细胞的程序是本领域的 技术人员公知的。（参见，例如 Sambrook&Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed. ,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001 ;和Ausubel et al. ,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley InterScience, NY,1995)〇
[0195] 此外，标准的分子生物学技术（例如DNA分离、凝胶电泳、核酸的酶促限 制性修饰、Southern分析、细胞的转化等）是技术人员已知的且被例如Sambrook et al. (1989)"Molecular Cloning:a laboratory manual"， Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,New York and Innis et al. (1990)〃PCR protocols, a guide to methods and applications〃Academic Press, San Diego 描述。
[0196] 可以按照标准的PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板和恰当 的寡核苷酸引物扩增适用于本发明所述的方法的核酸。由此扩增的核酸可被克隆至恰当的 载体（如果期望）和/或通过核酸序列分析被表征。
[0197] 可实施本发明所述的方法以使两种或更多种核酸被重组为单一核酸，之后其与靶 位点重组。
[0198] 可实施本发明所述的方法，其中所述的两种或更多种核酸的相互重组以及与靶位 点的重组同时发生。
[0199] 在本发明所述的方法中，至少两种核酸中的两种可各包含编码标记的序列的一部 分以使它们总共包含完整的编码标记的序列。
[0200] 可实施本发明所述的方法以表达针对位点特异性重组位点的重组酶，从而使位于 两个位点特异性重组位点之间的序列被外重组。
[0201] 标记和重组酶的表达典型地受控制序列控制，其中所述控制序列包括能够使重组 酶在宿主细胞表达的启动子。也就是说，编码标记和重组酶的序列典型地与启动子序列可 操作地连接。
[0202] 术语"可操作地连接"或"可操作地相连"或其类似物在本文中被定义为下述构型： 其中控制序列被放置在相对于DNA序列的编码序列的恰当位置以使控制序列指导mRNA或 多肽的产生。
[0203] 术语"控制序列"在本文中被定义为包括对在体外或宿主细胞中产生mRNA或多肽 而言是必须的或有益的所有组分。每个控制序列相对编码多肽的核酸序列而言可以是天然 或外源的。这种控制序列包括但不限于引导子（leader)、Shine-Delgarno序列、最佳的翻 译起始序列（如Kozak，1991，J. Biol. Chem. 266:19867-19870中所述）、聚腺苷酸化序列、 原-肽序列（pro-peptide sequence)、前-原-肽序列（pre-pro-peptide sequence)、启 动子、信号序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子、转录终止信号以及翻译起始信号 和翻译终止信号。可针对控制序列的特定目的而对其进行优化。本发明中使用的优选的优 化控制序列是W02006/077258中描述的那些。
[0204] 术语"启动子"在本文中被定义为下述DNA序列：其与RNA聚合酶结合并且将聚合 酶引导至编码生物化合物的核酸序列的正确下游转录起始位点以起始转录。RNA聚合酶有 效地催化与编码区的合适DNA链互补的信使RNA的组装。术语"启动子"还可被理解为包 括用于在转录成mRNA之后的翻译的5'-非编码区（启动子和翻译起点之间）、顺式作用转 录控制元件（如增强子）和能与转录因子相互作用的其它核苷酸序列。
[0205] 因此，可通过提供位于第一核酸上的启动子和位于第二核酸上的编码序列以分开 标记，从而使启动子和编码序列通过重组被可操作地连接，即重组将产生有功能的编码标 记的序列。
[0206] 启动子可以是适用于显示转录活性的真核或原核宿主细胞的任何适当的启动子 序列，其包括突变的启动子、截短的启动子和杂合的启动子，可以从编码相对于细胞是同源 的（天然的）或异源的（外源的）的胞外或胞内多肽的多核苷酸中获得启动子。启动子可 以是组成型或诱导型启动子。通过诱导性启动子表达重组酶将允许位于位点特异性重组位 点之间的序列的外重组被控制，例如包括编码重组酶的序列。
[0207] 启动子可以是组成型或诱导型启动子。
[0208] 可使用的诱导型启动子的实例是淀粉_、纤维素_、半纤维素（比如木聚糖-和/ 或木糖-诱导型）、铜_、油酸-诱导型启动子。启动子可选自下述组，该组包括但不限于从 编码以下的多核苷酸中获得的启动子：A.oryzae TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨 酸蛋白酶、A. niger中性α -淀粉酶、A. niger酸稳定的α -淀粉酶、A. niger或A. awamori 葡糖淀粉酶（glaA)、A. niger或A. awamori木聚糖内切酶（xlnA)或β -木糖苷酶（xlnD)、 T. reesei纤维二糖水解酶I (CBHI)、R. miehei脂肪酶、A. oryzae碱性蛋白酶、A. oryzae磷 酸丙糖异构酶、A. nidulans乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡糖苷酶（W000/56900)、 Fusarium venenatum Dania (W000/56900)> Fusarium venenatum Quinn(W000/56900)> Fusarium oxysporum 类膜蛋白酶蛋白酶（W096/00787)、Trichoderma reeseiP-葡萄糖 苷酶、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶I、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶II、 Trichoderma reesei 内切葡聚糖酶 I、Trichoderma reesei 内切葡聚糖酶 IKTrichoderma reesei 内切葡聚糖酶 III、Trichoderma reesei 内切葡聚糖酶 IV、Trichoderma reesei 内切葡聚糖酶V、Trichoderma reesei木聚糖酶I、Trichoderma reesei木聚糖酶II和 Trichoderma reeseiP-木聚苷酶，和NA2_tpi启动子（来自于编码A.niger中性α-淀 粉酶和A. Oryzae磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的启动子的杂合物）及其突变的、截短的和杂 合的启动子。启动子的其它实例是W02006/092396和W02005/100573中描述的启动子，其 通过引用而被并入本文。使用启动子的另一实例描述于W02008/098933中。诱导型（异源 的）启动子的其它实例是醇诱导型启动子alcA、使用四环素-响应启动子的tet系统、雌激 素-响应启动子（Pachlinger et al. (2005)，Appl&Environmental Microbiol672_678)。
[0209] 控制序列还可以包括合适的转录终止子（终止子）序列，其被丝状真菌细胞识别 以终止转录。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3'_末端可操作地连接。在细胞中有功 能的任何终止子都可被用于本发明。
[0210] 控制序列还可以是合适的引导序列（引导子），其是对丝状真菌细胞的翻译很重 要的mRNA的非翻译区。引导序列与编码多肽的核酸序列的5'-端可操作地连接。在细胞 中有功能的任何引导序列都可被用于本发明。
[0211] 取决于宿主，可以从编码A. oryzae TAKA淀粉酶、A. nidulans丙糖磷酸异构酶以 及A. niger GlaA和植酸酶的多核苷酸中获得合适的引导子。
[0212] 可以从Penicillium IPNS基因或pcbC基因、β微管蛋白基因中分离其它的控制 序列。W001/21779中引用的所有的控制序列均通过引用被并入本文。
[0213] 控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，其与核酸序列的3' -末端可操作地连接，转 录时，其被丝状真菌细胞识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。在细胞中有功能 的任何聚腺苷酸化序列都可被用于本发明。
[0214] 如本文所述，在本发明所述的方法中，所述的两种或更多种核酸总共包含编码标 记的序列以使所述的两种或更多种核酸的重组导致所述的编码标记的序列被定位于同源 重组位点之间。
[0215] 两种或更多种核酸的重组可导致所述编码标记的序列被定位于位点特异性重组 位点之间以使标记可通过重组酶的表达而被外重组。
[0216] 可以使用任何合适的标记并且公知这种标记用于确定核酸是否被包括在细胞内。 典型地，标记（例如可选择标记）允许易于选择被转化的细胞。可选择标记是其产物提供 杀虫剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。
[0217] 标记基因的实例包括但不限于：（1)核酸区段，其编码的产物提供对否则有毒的 化合物的抗性（例如抗生素）；（2)核酸区段，其编码在受体细胞中否则缺乏的产物（例如 必需产物、tRNA基因、营养缺陷型标记）；（3)核酸区段，其编码的产物抑制基因产物的活 性；(4)核酸区段，其编码的产物易于被鉴定（例如表型标记（例如抗生素抗性标记（例如 β -内酰胺酶））、β -半乳糖苷酶、荧光或其它有色标记（例如绿色荧光蛋白（GFP)、黄色荧 光蛋白（YFP)、红色荧光蛋白（RFP)和青色荧光蛋白（CFP)和细胞表面蛋白）；（5)核酸区 段，其与否则对细胞生存和/或功能有害的产物结合；(6)核酸区段，其否则抑制以上1-5 中所述的任何核酸区段的活性（例如反义寡核苷酸）；（7)核酸区段，其与修饰底物的产物 结合（例如限制性内切酶）；(8)核酸区段，其可被用于分离或鉴定期望的分子（例如特异 性蛋白结合位点）；(9)核酸区段，其编码否则可无功能的特定核苷酸序列（例如分子亚群 的PCR扩增）；（10)核酸区段，当其缺失时，将直接或间接授予对特定化合物的抗性或敏感 性；（11)核酸区段，其编码在受体细胞中有毒的或将相对无毒的化合物转化为有毒的化合 物的产物（例如单纯疱疹胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶）；（12)核酸区段，其抑制含有它