颗粒紧密呈现多边形，相同时期突变 体fl 〇7靠近种子外围的造粉体内部淀粉颗粒不能紧密排，最终表现为复粒淀粉颗粒是碎 裂的（见图3)。
[0034] 综上所述，在突变体fl〇7中由于胚乳外周造粉体发育异常，导致复合淀粉颗粒在 发育后期呈现碎裂的形态，最终造成种子外周粉质的表型。
[0035] 二、突变基因定位
[0036] 1、突变基因初步定位
[0037] 用突变体fl〇7与籼稻品种Peiai64杂交，在fl 〇7/Peiai64的匕分离群体中随机 选取籽粒粉质的种子，发芽后，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA，构成1个混合基因 组池。首先，用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物在flo7和Peiai64之间进行多态性分 析，之后每间隔10cM左右挑选一对在两个亲本间有多态的引物。两个亲本DNA连同混池 DNA共计三个DNA样本，利用挑选好的覆盖12条染色体的且具有多态的引物进行分析，最后 将FL07定位在第10染色体标记10-1和10-3之间。
[0038] 上述SSR标记分析的方法如下所述：
[0039] (1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：
[0040] ①取0. 2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装 好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GEN0/GRINDER仪器上粉碎样品 lmin〇
[0041]②加入 660ii1 提取液（含 100mM Tris-Hcl (PH 8. 0)，20mM EDTA(PH 8. 0)， 1. 4MNaCl，0. 2g/ml CTAB的溶液），漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。
[0042] ③加入40iil 20% SDS，65°C温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。
[0043] ④加入lOOiil5M NaCl，温和混匀。
[0044] ?加入100^110\0^8,651：温浴1〇1^11，间断轻轻上下颠倒混匀。
[0045] ⑥加入900 u 1氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。
[0046] ⑦转移上清液至1. 5mL Eppendorf管中，加入600 u 1异丙醇，混匀，12000rpm离心 5min〇
[0047] ⑧弃上清液，沉淀用70% (体积百分含量）乙醇漂洗一次，室温凉干。
[0048] ⑨加入lOOul 1XTE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶 液）溶解DNA。
[0049] ⑩取2 ill电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度（Bechman Instrument Inc. U. S. A) 〇
[0050](2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/ ill，作为模板进行PCR扩增；
[0051] PCR反应体系（lOiil) :DNA(20ng/ul)lul，上游引物（2pmol/ul)lul，下游引 物（2pmol/ul)lul，10xBuffer(MgCl2free)lul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl2(25mM)0.6ul， rTaq(5u/ul)0. lul，ddH20 5. lul，共10ul。
[0052] PCR反应程序：94.0°C变性5min;94.0°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸lmin， 共循环35次；72°C延伸7min ;10°C保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进 行。
[0053] (3) SSR标记的PCR产物检测
[0054] 扩增产物用8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照 比较扩增产物的分子量大小，银染显色。
[0055] 2、突变基因精细定位
[0056] 根据初步定位的结果，在突变位点所在区域间隔一定区段自行开发SSR标记，以 便在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体位点。从fl 〇7/Peiai64杂交组 合获得的F2分离群体中挑出确认为突变表型的F2种子，用于突变位点的精细定位。利用公 共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、Indel分子标记对突变 位点进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变位点，具体方法如下：
[0057] (l)SSR标记开发
[0058] 将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/ PAC克隆序列。用SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列（重复次数彡6);将这些SSR及 其邻近400~500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果 两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利 用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物，并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自 行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在flo7和Peiai64之间的多态性，表现多态者 用作精细定位FL07基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。
[0059] 表2用于精细定位的分子标记
【主权项】
1. 水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FL07,其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 编码权利要求1所述的水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FL07的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于其CDS序列如SEQ ID NO. 1所示。
4. 含有权利要求2所述基因的重组表达载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于以pCAMBIA2300-Actin载体为出 发载体，将权利要求2或3所述的基因插入多克隆位点Smal之间得到。
6. 含有权利要求2所述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7. 权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4或5所述重组表达载体、 权利要求6所述的表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在改善水稻造粉体发育中 的应用。
8. -种培育造粉体发育正常的转基因水稻的方法，其特征在于将权利要求2或3所述 基因导入造粉体发育异常的水稻中，得到造粉体发育正常的转基因水稻；所述造粉体发育 异常水稻为胚乳外周造粉体碎裂的水稻；所述造粉体发育正常的转基因水稻为胚乳外周恢 复透明，造粉体形态正常的转基因水稻。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述基因通过权利要求4 或5所述重组表达载体导入造粉体发育异常水稻中。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述造粉体发育异常水稻为日本晴突变 体 flo7。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用，属于基因工程领域。本发明提供的蛋白质，命名为FLO7蛋白，来自水稻品种Nipponbare，蛋白序列如SEQ ID NO.1，cDNA序列如SEQ ID NO.2。本发明对于进一步阐明禾本科植物胚乳造粉体发育的分子机理并通过基因工程的技术和手段对谷物品质的遗传改良具有重要的理论意义和现实意义。
【IPC分类】C12N15-82, A01H5-10, C07K14-415, C12N15-29
【公开号】CN104628839
【申请号】CN201510059737
【发明人】万建民, 张龙, 江玲, 卢丙越, 杨春艳, 冯志明, 任玉龙, 郭秀平, 吴赴清
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月4日