NA，并反转录为cDNA，实时定量 PCR分析TamiR408基因的表达水平。
[0092]内参基因TaActin引物对序列如下：
[0093]上游引物：5' -TATGCCAGCGGTCGAACAAC-3'，如序列5所示；
[0094]下游引物：5' -GGAACAGCACCTCAGGGCAC-3'，如序列6所示；
[0095]目的基因TamiR408引物对序列如下：
[0096]上游引物：5' -GGATGGAGCAGAGCAAGG-3'，如序列7所示；
[0097]下游引物：5' -TGGCAACTCTCTCCCTCTTCTC-3'，如序列8所示；
[0098]实时定量PCR扩增体系为：SYBR，10yl;上游引物，0. 5yl;下游引物，0. 5yl;模 板，2 y 1 ;ddH20将总体积补充至20 y 1。扩增条件为：95°C预变性30秒；95°C变性5秒，60°C 退火10秒，72°C延伸15秒，45个循环。
[0099]结果如图1所示，TamiR408基因在根、茎、叶鞘的表达量较高。
[0100] 为明确TamiR408基因在茎端分生组织发育过程中的作用，分析了TamiR408基因 在茎端分生组织不同生长发育时期的表达水平（图2)，TamiR408基因在小麦单棱期和二 棱期的茎端分生组织及小穗中表达水平较低；在穗分化时期的茎端分生组织表达水平非常 高，推测TamiR408基因可能在茎端分生组织发育成穗的时期具有重要作用，其作用机理需 要进一步研宄。
[0101]实施例2、TamiR408基因的功能研宄
[0102] 一、植物重组载体pZP211 UBI: :TamiR408的构建
[0103]用限制性内切酶BamHI与KpnI酶切pZP211: :UBI表达载体（《玉 米ZmAATP基因的克隆及遗传转化载体的构建》，山东农业大学学报（自然科学版）， 2012, 43(3)321-327;公众可从山东农业大学获得）和实施例1的一的3得到的PCR产物，将 空表达载体酶切大片段和PCR产物酶切产物用用T4连接酶连接，操作步骤参照Fermentas 公司产品T4 DNA ligase说明书进行。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有 壮观霉素（50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有壮观霉素（50mg/ L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA并进行BamH I与Kpn I酶切鉴定，得 到243bp为阳性质粒。
[0104] 该阳性质粒为将序列表中序列1所示的核苷酸替换PZP211: :UBI载体的BamH I 与Kpn I酶切识别位点间的DNA片段得到的质粒，命名为pZP211 UBI: :TamiR408(图3)， 为表达miR408的重组载体。
[0105]将表达载体pZP211 UBI::TamiR408(图3)转化农杆菌C58C1感受态细胞，并获得 可供转化使用的农杆菌菌株，命名C58Cl/pZP211 UBI: :TamiR408(提取质粒BamH I与Kpn I酶切鉴定，得到243bp为C58Cl/pZP211 UBI: :TamiR408)。
[0106] 二、农杆菌介导的小麦幼胚转化及抗性植株的获得
[0107] 侵染前一天挑取农杆菌C58Cl/pZP211 UBI::TamiR408单菌落，接种于含有50mg/ L壮观霉素的YEP液体培养基中，28°C，180rpm振荡过夜。
[0108] 收集小麦品种轮选987 (以下也称为野生型小麦）授粉后10-12天的幼胚（长度 在1. Omm-1. 2mm之间）接种在预培养基上25°C暗培养4天（图4A)，将愈伤组织集中至灭 菌小培养皿中，加入农杆菌悬浮液至愈伤组织全部浸没，室温放置30分钟。将农杆菌悬浮 菌液吸出后，侵染的愈伤组织转移至带滤纸的灭菌空培养皿中，25°C暗培养2天，移至筛选 培养基中（图4B)筛选2-3周，筛选剂为G418,筛选浓度为25mg/L，同时添加250mg/L羧苄 青霉素抑制农杆菌生长；筛选后的愈伤组织转入分化培养基（图4C)。2周后，将分化得到 的幼苗转入壮苗培养基（图4D)，将生长健壮的幼苗炼苗后，移栽至花盆（图4E)置于可控 温室，得到T0代转TamiR408小麦。
[0109] 本实验的培养基为添加了2. Omg/L dicamba的MS培养基（Murashige and Skoog, 1962)，其中的dicamba为3, 6-二氯-2-甲氧基苯甲酸。
[0110] 三、转TamiR408小麦的分子检测
[0111] 1、候选转基因植株的PCR检测
[0112] 采用CTAB法（Sambrook and Russell，分子克隆实验指南，2001)提取T0代转 TamiR408小麦株系S2-5、Gul05、Gul07、Gul08植株基因组DNA，设计引物检测标记基因NPT II。以野生型小麦为对照。
[0113] 标记基因NPT II基因引物对如下：
[0114]上游引物：5' -GTGGAGAGGCTAITCGGCTATGACTG-3'，如序列9所示；
[0115]下游引物：5' -AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC-3'，如序列10所示；
[0116] 标记基因NPT II扩增序列长度为650bp，扩增条件为：94°C预变性8分钟；94°C变 性30秒，59°C退火30秒，72°C延伸45秒，循环35次；72°C延伸10分钟。
[0117] 结果如图5A所示，可以看出，得到650bp的为含有标记基因NPT II的T0代转 TamiR408小麦，表明S2-5、Gul05、Gul07、Gul08为阳性转基因植株。
[0118] 野生型小麦没有650bp标记基因NPT II。
[0119] 2、利用Southern blot技术对候选转基因植株进行鉴定
[0120] 以T0代转TamiR408小麦株系S2-5、Gul05、Gul07、Gul08叶片为实验材料，参照 CTAB法提取总基因组DNA，按照Roche公司地高辛试剂盒的说明书步骤进行Southern杂交 检测。以野生型小麦为对照。
[0121] 探针引物对序列如下：
[0122]上游引物：5' -GAGAGAAAGAGAGITGAITITGTGAG-3'，如序列11所示；
[0123]下游引物：5' -CTATAACAGGGGCAGAAAATGG-3'，如序列12所示；
[0124] 结果如图5B所示，小麦为异源六倍体，野生型植株可检测到三条内源带，候选T0 代转TamiR408小麦株系Gul05、S2-5、Gul07和Gul08中均能检测到四条带，由此可知目的 基因TamiR408为单拷贝插入，确定为阳性转基因植株。
[0125] 3、实时定量PCR分析TamiR408基因在阳性转基因株系中的表达水平
[0126]提取TO代转TamiR408小麦株系S2-5、Gul05、Gul07、Gul08叶片的总RNA，并反转 录为cDNA。
[0127]内参基因TaActin引物对序列如下：
[0128]上游引物：5' -TATGCCAGCGGTCGAACAAC-3'，如序列5所示；
[0129]下游引物：5' -GGAACAGCACCTCAGGGCAC-3'，如序列6所示；
[0130] 目的基因TamiR408引物对序列如下：
[0131]上游引物：5' -GGATGGAGCAGAGCAAGG-3'，如序列7所示；
[0132]下游引物：5' -TGGCAACTCTCTCCCTCTTCTC-3'，如序列8所示；
[0133]实时定量PCR扩增体系为：SYBR，10yl;上游引物，0. 5yl;下游引物，0. 5yl;模 板，2 y 1 ;ddH20将总体积补充至20 y 1。扩增条件为：95°C预变性30秒；95°C变性5秒，60°C 退火10秒，72°C延伸15秒，45个循环。
[0134]结果如图5C所示，阳性转基因株系Gul05、S2-5、Gul07、Gul08中TamiR408基因 的表达量均高于野生型植株，说明TamiR408基因不仅整合到阳性转基因植株的基因组内， 而且在阳性转基因小麦体内转录水平得到有效表达。
[0135]从上述结果可以看出，T0代转TamiR408小麦株系S2-5、Gul05、Gul07、Gul08为阳 性转TamiR408小麦。
[0136]采用同样的方法将空载体pZP211: :UBI转入野生型小麦中，得到T0代转 PZP211: :UBI小麦，按照上述方法检测，结果与野生型无显著差异。
[0137]将上述T0代植株播种，培育，得到T1代植株。
[0138]四、阳性转基因株系表型分析
[0139] 1、抽穗时间
[0140]将T1代转pZP211: :UBI小麦、T1代转TamiR408小麦株系S2-5、Gul05、Gul07、 Gul08和野生型小麦同时播种，对各株系的抽穗时间进行观察和统计，每个株系20株，实验 重复3次，结果取平均值。
[0141]在播种后第193天，观察表型如图6A所示，可以看出，T1代转TamiR408小麦株系 抽穗时间早于野生型小麦；
[0142]在播种后第193天，统计抽穗时间结果如图6B所示，Gul05株系抽穗时间比野生 型植株提前约5天；S2-5、Gul07、Gul08株系