抽穗时间比野生型植株提前约4天。统计结果 分析达到极显著差异，说明阳性转基因株系的抽穗时间明显提前。
[0143] T1代转pZP211::UBI小麦和野生型小麦抽穗时间结果统计分析无显著差异。
[0144] 2、FT基因表达量检测
[0145] FT基因编码产生的成花激素能调控植物的开花时间，因此FT基因是成花转变所 必需的（Kardailsky et al.，1999 ;Kojima et al.，1999)〇
[0146]提取T1代转pZP211: :UBI小麦株系Gul05、S2-5、Gul07、Gul08小穗的总RNA，并 反转录为cDNA，实时定量PCR分析FT基因的表达量，以T1代转pZP211: : UBI小麦和野生型 小麦为对照。
[0147]内参基因TaActin引物对序列如下：
[0148]上游引物：5' -TATGCCAGCGGTCGAACAAC-3'，如序列5所示；
[0149]下游引物：5' -GGAACAGCACCTCAGGGCAC-3'，如序列6所示；
[0150]目的基因FT引物对序列如下：
[0151]上游引物：5'-CTTCGTCCGGACCACCAACCTC-3'，如序列13所示；
[0152]下游引物：5' -GGITGGGATCGCTTGGACTTG-3'，如序列14所示；
[0153]实时定量PCR扩增体系为：SYBR，10yl;上游引物，0. 5yl;下游引物，0. 5yl;模 板，2 y 1 ;ddH20将总体积补充至20 y 1。扩增条件为：95°C预变性30秒；95°C变性5秒，60°C 退火10秒，72°C延伸15秒，45个循环。
[0154] 结果如图6C，与野生型小麦相比，在不同转基因株系中FT基因的表达量均为上 调，并且上调幅度与转基因小麦的抽穗时间提前程度相一致。表明FT基因表达量的上调是 引起阳性转基因小麦株系抽穗时间提前的重要因素之一。
[0155] T1代转pZP211: :UBI小麦和野生型小麦结果无显著差异。
[0156] 3、旗叶夹角
[0157]将T1代转pZP211: :UBI小麦、T1代转TamiR408小麦株系S2-5、Gul05、Gul07、 Gul08和野生型小麦同时播种，小麦进入乳熟期后，统计各株系旗叶夹角度数。每个株系20 株，实验重复3次，结果取平均值。
[0158]结果如图7所示，野生型植株旗叶夹角为90度，Gul05株系旗叶夹角达到150度， 有极显著差异；S2-5株系旗叶夹角为130度，有显著性差异；Gul07株系和Gul08株系旗叶 夹角变化较小，约为105度，与野生型植株相比，无显著性差异。可见转基因植株具有旗叶 夹角变大的表型。
[0159]T1代转pZP211: :UBI小麦和野生型小麦结果无显著差异。
[0160] 4、株高和节间距
[0161]将T1代转pZP211: :UBI小麦、T1代转TamiR408小麦株系S2-5、Gul05、Gul07、 Gul08和野生型小麦同时播种，小麦进入完全成熟后，统计各株系株高。每个株系20株，实 验重复3次，结果取平均值。
[0162]结果如图8所示，8A显示表型，8B为株高统计数据；与野生型小麦植株相比，阳性 转基因株系Gul05株高约高出6. 9cm，阳性转基因株系S2-5高出约6. 4cm，均有极显著差 异。
[0163]统计上述株系的节间距，结果如图8C所示，第一节间距至第六节间距的节间长度 依次缩短，不同的转基因株系同一节间距长度有所差异，阳性转基因株系Gul05的第一节 间距最长；所有株系第四节间距和第五节间距长度变化较为明显。总体来说，与野生型小麦 相比，阳性转基因株系节间距增长。
[0164] T1代转pZP211: :UBI小麦和野生型小麦结果无显著差异。
[0165] 5、叶绿素含量
[0166]将T1代转pZP211: :UBI小麦、T1代转TamiR408小麦株系S2-5、Gul05、Gul07、 Gul08和野生型小麦同时播种，小麦植株自授粉之日起28天内每隔7天进行一次叶绿素含 量测定，测定方法参照《植物叶绿素测定方法的再探讨》（刘秀丽等，江苏农业研宄，1990， 20(3)：46-47)〇
[0167]结果如图9所示，叶绿素含量总体变化趋势一致。授粉之日到授粉后21天，叶绿 素含量维持较高水平，阳性转基因株系Gul05、S2-5、Gul07和Gul08的叶绿素含量均比野生 型植株高；至授粉后28天，阳性转基因株系和野生型植株的叶绿素含量均急剧下降，可能 与植株成熟有关。由此可见，自授粉开始至植株成熟，阳性转基因植株的叶绿素含量高于野 生型植株。
[0168] T1代转pZP211: :UBI小麦和野生型小麦结果无显著差异。
[0169]本发明将上述表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些 方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法、子房注射法等。本发明所用 选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因（NPTII)，可进一步包括其它选择标记基因和报告 基因。本发明选用的筛选抗生素为G418,选用卡那霉素和巴龙霉素等抗生素也可起到相同 筛选效果。本发明中TamiR408基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它可 以改良农艺性状的转基因植物，包括此类转基因植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这 些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种 microRNA，是如下 1)或 2): 1) 序列表中序列2所示的RNA ; 2) 将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/ 或添加且与植物开花相关的由序列2衍生的RNA。
2. 编码权利要求1所述microRNA的DNA分子。
3. 如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-3)中任一种 的DNA分子： 1) 编码区为序列表中序列1所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物开花相关RNA的DNA分子； 3) 与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98 %或至少具有 99%同源性且编码与植物开花时间相关RNA的DNA分子。
4. 含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5. 如权利要求4所述的重组载体，其特征在于： 所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体中，得到表达权利要求 1所述mi croRNA的重组载体。
6. 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述表达载体为pZP211: :UBI。
7. 扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。
8. 权利要求1所述microRNA、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载 体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物开花时间和/或改变植物株型中的应用； 所述调节植物开花时间具体体现在抽穗时间提前和/或提高FT基因表达量； 所述改变植物株型具体体现在增加旗叶夹角、增加株高、增加节间距和/或提高叶绿 素含量； 所述目的植物具体为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物进一步具体为小麦。
9. 一种培育转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述microRNA的DNA分子导入目 的植物，获得转基因植物， 所述转基因植物具有如下特征： 1) 所述转基因植物的抽穗时间早于所述目的植物； 2) 所述转基因植物的FT基因表达量大于所述目的植物； 3) 所述转基因植物的旗叶夹角大于所述目的植物； 4) 所述转基因植物的株高大于所述目的植物； 5) 所述转基因植物的节间距大于所述目的植物； 6) 所述转基因植物的叶绿素含量大于所述目的植物。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述microRNA的 DNA分子通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物； 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。
【专利摘要】本发明公开了小麦microRNA408及其编码基因与应用。本发明提供了一种microRNA，是如下1)或2)：1)序列表中序列2所示的RNA；2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花相关的由序列2衍生的RNA。本发明的实验证明，本发明通过克隆TamiR408基因，发现利用该基因所得的转基因农作物具有抽穗时间提前、株型改变等表型。本发明要解决的技术问题是在小麦中过表达TamiR408基因，改良小麦成熟期和株型等农艺性状，明确其在农业生产中的应用，挖掘其潜在的经济价值和社会价值。
【IPC分类】C12N15-84, C12N1-15, C12N1-19, C12N15-113, A01H5-00, C12N15-11, C12N1-21, C12N15-63
【公开号】CN104651366
【申请号】CN201510068194
【发明人】张宪省, 赵翔宇, 吴吉云, 陈祥彬, 别晓敏, 洪坡
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月9日