个性化癌症疫苗和过继免疫细胞治疗的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年7月12日提交的美国临时申请61/670, 931的权益，其通过引 用纳入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及来自癌症患者的癌细胞的表达基因中突变的鉴定和该突变在制备癌 症疫苗和过继免疫细胞治疗中的用途。
[0004] 发明背景
[0005] 癌症是美国的第二大死因。估计在2010年，约570, 000人会死于癌症并诊断出 150万新病例（1)。对于早期癌症（未扩散到淋巴结且是非转移性的），手术移除是非常有 效的治疗。然而，对于较晚期的病例，使用标准的、非特异性癌症治疗（化疗和放疗）。这 些治疗影响了许多健康细胞并导致毒性升高。医学伦理学最重要的原则之一 "primum non nocere (首先不要造成伤害）"通常不适用于癌症治疗，其中需要对患者使用毒性很高的治 疗方案，该治疗方案仅对一部分受治疗个体有效。此外，即使最初经成功治疗的个体也存在 复发风险且在随后的各次复发后变得更难治疗。
[0006] 使用适应性免疫系统杀死癌细胞而不损伤正常细胞的想法是数十年来的目标 (关于综述，参见Dunn 2002(2))。为成为癌细胞，健康细胞经历了多次体细胞突变（3, 4)。 这类突变可以是适应性免疫系统的靶标，所述适应性免疫系统的功能是从自身中识别和消 除微小变化。使用免疫疗法成功治疗癌症的可能性得到了以下发现的支持：(a)可从患有 肿瘤的患者中分离肿瘤特异性淋巴细胞（6, 7) ;(b)浸润肿瘤（或在循环中）的肿瘤特异性 淋巴细胞的存在与良好预后相关（8);以及（c)已鉴定到肿瘤细胞上由T淋巴细胞识别的 抗原（9, 10, 12)。相关的还有：(a)过继细胞免疫疗法对于经历骨髓移植（BMT)的患者中爱 泼斯坦-巴尔病毒（EBV)相关的淋巴瘤和巨细胞病毒（CMV)感染显示出的有效性（11)，以 及（b)过继细胞疗法在治疗患有转移性黑色素瘤的患者中的成功（7)。
[0007] 然而，肿瘤抗原鉴定及其向免疫治疗的转化仍面临诸多问题。因此，能够在较早期 以较有效的方式确定抗原是一个优势。如本文所述鉴定并使用抗原的方法使得对患者个性 化的诊断和治疗成为可能，这增加了治疗成功的可能性。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了鉴定来自癌症患者的癌细胞的表达基因中的突变和使用该突变制 备癌症疫苗和过继免疫细胞治疗以治疗癌症患者的方法。来自癌细胞的核酸序列获自平行 测序平台，其采用平行处理癌细胞的核酸以生成序列读数并将序列读数映射至具有参考基 因序列的数据库。在一些实施方式中，所述平行测序平台对测序结果使用某些过滤（如小 于20x的覆盖深度）并且/或可不进行碱基比对质量（BAQ)算法过滤。
[0009] 编码所有或部分表达基因的突变序列被鉴定为具有突变位置氨基酸，所述突变位 置氨基酸取代了蛋白的野生型序列中同一位置的野生型位置氨基酸。
[0010] 可通过鉴定HLA型和/或HLA超类型（supertype)癌症患者并随后针对特定HLA 型和/或HLA超类型选择一种或多种氨基酸作为突变位置氨基酸和/或野生型位置氨基 酸，从而实现突变序列的进一步选择。图7显示了各HLA型和/或HLA超类型的候选突变 位置氨基酸和/或野生型位置氨基酸。或者，可以忽视个体的HLA型和/或HLA超类型并 使用选自酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸和丙氨酸的一种或多种氨 基酸进行进一步选择。
[0011] 根据本发明，对含有感兴趣突变序列的肽评估其结合癌症患者的HLA组织相容性 抗原的能力。这可使用基于计算机的算法进行计算机模拟以预测HLA结合的肽。或者或另 外，可通过合成肽并测试其与HLA组织相容性抗原的结合来评估结合HLA组织相容性抗原 的能力。对序列与HLA组织相容性抗原之间结合的测试并非必须，但可用于在进一步测试 前缩小潜在的癌抗原组。
[0012] 在其他实施方式中，可合成含有感兴趣突变序列的肽并评估其对从癌症患者或 HLA匹配供体（匹配类和/或超类型）中制备的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)细胞系的激活。 在这些情况下，通过接触以下两种细胞类型获得CTL细胞系：来自癌症患者或HLA匹配供体 的单核细胞和来自癌症患者的癌细胞。CTL细胞系可使用就CD8+细胞进行富集的单核细胞 制备且还包括添加来自癌症患者的自体CD4+T细胞和/或树突细胞或者来自HLA匹配供体 的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。在仅使用肽刺激CTL的实施方式中，只需要匹配HLA型 和/或亚型的供体。
[0013] 在另一个实施方式中，鉴定来自癌症患者的癌细胞的表达基因中突变并使用该突 变以制备癌症疫苗和用于治疗癌症患者的过继免疫细胞治疗的方法包括通过所述平行测 序平台获得来自癌细胞的核酸序列。编码所有或部分表达基因的突变体序列被鉴定为具有 突变位置氨基酸，该突变位置氨基酸取代了野生型蛋白序列中同一位置的野生型位置氨基 酸。合成含有感兴趣突变序列的肽和任选的对应野生型序列肽并评估其对从癌症患者或 HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)细胞系的激活。在这些情况下，通过使 来自癌症患者或HLA匹配供体的单核细胞接触来自癌症患者的癌细胞来获得CTL细胞系。 CTL细胞系可使用就CD8+细胞进行富集的单核细胞制备且还包括添加来自癌症患者的自体 CD4+T细胞和/或树突细胞或者来自HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。
[0014] 具体而言，在一个方面，本发明提供了一种鉴定用于制备癌症疫苗的癌抗原的方 法，该方法包括
[0015] a)获取来自癌症患者的癌细胞的核酸的多条突变序列，该突变序列编码所有或部 分表达基因且所述突变序列各具有突变位置氨基酸，该突变位置氨基酸取代了野生型蛋白 序列中同一位置的野生型位置氨基酸或其他突变（如插入或缺失），所述突变序列通过使 用平行测序平台获得，该平行测序平台对所述癌细胞的核酸进行平行处理以生成序列读数 并将序列读数映射至具有参考基因序列的数据库；以及
[0016] b)通过鉴定癌症患者的HLA型或超类型从步骤a)中鉴定到的序列中选择突变序 列并随后使用图7为所述HLA型或超类型的氨基酸选择作为突变位置氨基酸和/或野生型 位置氨基酸的氨基酸，其中鉴定了用于制备癌症疫苗的癌抗原。
[0017] 在另一个方面，本发明提供了一种鉴定用于制备癌症疫苗的癌抗原的方法，该方 法包括
[0018] a)获取来自癌症患者的癌细胞的核酸的多条突变序列，该突变序列编码所有或部 分表达基因且该突变序列各具有突变位置氨基酸，该突变位置氨基酸取代了野生型蛋白序 列中同一位置的野生型位置氨基酸或其他突变（如插入或缺失），该突变序列通过使用平 行测序平台获得，该平行测序平台对所述癌细胞的核酸进行平行处理以生成序列读数并将 序列读数映射至具有参考基因序列的数据库；以及
[0019] b)通过确定由至少一条突变序列编码的至少一个肽结合癌症患者的HLA型或超 类型，从步骤a)中获得的多条突变序列中鉴定用于制备癌症疫苗的至少一条突变序列。
[0020] 在另一个方面，本发明提供了一种用于预测本文所述疗法（如过继