只有在使用系统性或无偏向的方法对许多个体鉴定到免疫库后，才可能确定 免疫原性突变的共有模式。例如，一些基因受共有突变簇影响的发现可导致个性化较低的 疗法的应用。
[0036] 本发明提供了鉴定构成来自单个癌症患者的癌细胞中肿瘤相关和/或肿瘤排斥 抗原的可用突变以及使用该抗原免疫来自患者的T细胞或HLA匹配供体的T细胞以识别并 杀死癌细胞的方法。为此，使用下一代测序技术对癌细胞的转录组和外显子组以及来自癌 症患者的EBV淋巴母细胞或PHA刺激的T细胞的外显子组进行测序。在使用骨髓移植的特 定癌症中（例如在白血病中），还可将来自癌症患者细胞的经测序的外显子组与来自HLA匹 配的骨髓供体的EBV淋巴母细胞或PHA刺激的细胞的外显子组比较。该比较将得到被翻译 成肽并用于过继转移治疗的基因的全部列表。
[0037] 下一代测序策略使得能够在鉴定涉及转化的基因的尝试中进行肿瘤细胞的广泛 分子表征。可获得的信息包括拷贝数目、表达水平和体细胞突变。
[0038] 本文所用术语"下一代测序"（"NGS"）、"第二代测序"和"大规模平行测序"包括 与测序过程平行的高通量测序方法，同时生成数千至数百万条序列（16, 17)。平行化测序所 产生的序列数目通常超过10, 〇〇〇,更通常超过100, 〇〇〇且最通常超过1，〇〇〇, 000。NGS设计 与桑格（Sanger)测序不同，后者也称作"毛细管测序"或"第一代测序"，其基于单个测序反 应中生成的链终止产物的电泳分离。
[0039] 虽然各NGS平台在工程构造和测序化学方面具有差异，但大多数平台的共同点 是通过使用流动池 （flow cell)平行处理的单个DNA分子或空间分离且克隆扩增的DNA 模板。将来自平行处理的大量输出物由主要成像输出物或检测输出物转化为序列。集 成算法包进行了核心主要数据转化步骤：图像分析、强度评分、碱基读出以及将子序列 读数与参考序列比对。参考序列包括人参考基因组NCBI37/hgl9序列，其可获自加州 大学圣克鲁兹分校（University of California Santa Cruz)的基因组生物信息学组 (Genome Bioinformatics Group)(也可获自万维网）。公共序列信息的其他来源包括 GenBank、dbEST、dbSTS、EMBL (欧洲分子生物学实验室（the European Molecular Biology Laboratory))和 DDBJ (日本 DNA 数据库（the DNA Databank of Japan))。因此，NGS 指使 用核酸的平行处理以进行序列读取并将序列读数映射至具有参考基因序列的数据库的平 行测序平台。
[0040] 用于使用NGS选择癌症特异性序列的本方法具有鉴定稀有突变体的潜力，该稀有 突变体可能在使用更广泛的序列过滤时丢失。即使单个肿瘤也可含有不同类型的癌细胞和 不同类型的干细胞，其持续进行自我复制并产生这些类型的癌细胞。排除序列比对和突变 序列选择步骤之间的过滤可能导致更多的假阳性，但也提供了需要针对其进行免疫以治疗 癌症的稀有序列突变
[0041] 可对来自NGS系统的序列数据进行过滤以提供有助于准确性的早期选择标准。常 见的过滤是"覆盖的深度"、"测序覆盖"或"覆盖深度"，指序列读数中给定DNA核苷酸出现 的平均次数（换言之，这是覆盖任意特定碱基的读取的平均数目）（参见例如Nielsen等， Nature Reviews Genetics 12:4432011)。覆盖越大，准确读出序列差异的可能性越大。对 于如本文所述进行癌症突变的检测，使用小于20x的覆盖深度，但更优选的覆盖深度是小 于15x、小于10x、小于7x、小于5x、小于4x、小于3x、小于2x和lx。覆盖深度也可以在突变 的情况下表示为对于任意特定碱基参考和变体组合的平均读取数目（例如参考是患者或 供体EBV B细胞序列且变体是癌细胞序列）。对于癌症突变，参考+变体大于等于20可用 于以低深度置信区间进行鉴定（例如对参考18x加对突变2x)。
[0042] 另一种过滤是碱基比对质量（BAQ)，该方法精确测量读取的碱基被错误比对的概 率（例如参见Li, Bioinformatics ;27 (8) :1157 - 1158[2011])。通过默认开启碱基比对质 量（BAQ)计算并调节覆盖深度值以更好地模拟局部重新比对。BAQ是一种类似Phred的评 分，代表读取的碱基被错误比对的概率；其降低了插入缺失附近错配读数的碱基质量评分。 这旨在帮助排除由于小插入缺失附近比对矫作物而导致的假阳性SNP读数。可通过使用参 数调节过滤。可使用-B参数禁用BAQ或使用-E参数进行更灵敏的BAQ计算。
[0043] 密码子编码公司（CodonCode Corporation，58Beech Street，马萨诸塞州戴德姆， 02026)提供了 Phrap、Phred 和 Cross_match 的 Windows、Mac OS X 和 Unix 版本，用于序列组 装、质量碱基读出和快速序列比较的Phil Green程序。密码子编码公司还提供了Consed的 Unix 和 Linux 版本、David GordonBtt连群编辑器（contig editor)和用于 Phred 和 Phrap 的自动完成工具。读出碱基后，Phred检查各碱基读数周围的峰以向各碱基读数分配质量 评分。质量评分范围从4至约60,数值越高对应质量越高。质量评分与错误概率对数相关， 如下表所示：
[0044]
【主权项】
1. 一种鉴定用于制备癌症疫苗的癌抗原的方法，所述方法包括 a) 获取来自癌症患者的癌细胞的核酸的多条突变序列，所述突变序列编码所有或部分 表达基因且所述突变序列各具有突变位置氨基酸，所述突变位置氨基酸取代了野生型蛋白 序列中同一位置的野生型位置氨基酸，所述突变序列通过使用平行测序平台获得，所述平 行测序平台对所述癌细胞的核酸进行平行处理以生成序列读数并将序列读数映射至具有 参考基因序列的数据库；以及 b) 通过鉴定所述癌症患者的HLA型或超类型从步骤a)中鉴定到的序列中选择突变序 列并随后使用图7为所述HLA型或超类型选择作为所述突变位置氨基酸和/或野生型位置 氨基酸的氨基酸，其中鉴定了用于制备癌症疫苗的癌抗原。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，合成包含来自步骤b)的所述突变序列的肽并评估 所述肽对从所述癌症患者或HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)细胞系的激 活，所述CTL细胞系通过使来自所述癌症患者或所述HLA匹配供体的单核细胞接触来自所 述癌症患者的癌细胞来获得。
3. 如权利要求1所述的方法，其中，评估包含步骤b)中所选序列的肽与HLA组织相容 性抗原结合的能力。
4. 如权利要求3所述的方法，所述与HLA组织相容性抗原结合的能力使用用于预测 HLA结合肽的基于计算机的算法通过计算机模拟来评价。
5. 如权利要求4所述的方法，其中，合成据计算机模拟与HLA组织相容性抗原结合的肽 并评估所述肽对从所述癌症患者或HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)细胞 系的激活，所述CTL细胞系通过使来自所述癌症患者或所述HLA匹配供体的单核细胞接触 来自所述癌症患者的癌细胞来