线粒体dna拷贝数变异性的检测装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种可检测线粒体DNA拷贝数变异性、 进而应用于癌症早期诊断筛查的装置。
【背景技术】
[0002] 癌症是恶性肿瘤的统称，癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营 养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可转移到 全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热，最终还可破坏组织、器官的 结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终由于器官功能衰竭而死亡。
[0003]目前虽然已出现了通过检测基因的突变位点，用来指导用药以及作为癌症早筛的 标准，但是该方法主要的应用是发现癌症病人中肿瘤组织的突变情况，以便进行个性化治 疗；但不同癌症病人基因突变位点不一样，突变的频率也有差异，很难确定癌症的判别标 准，所以使用这个技术用于癌症的筛查特异性和准确率不高。
[0004] 人体血液中存在大量游离的DNA(cfDNA，cellfreeDNA)，它们主要来自体细胞 的凋亡、坏死或主动释放。目前已知癌症病人的cfDNA含量显著高于正常人，平均约为正 常人的三倍以上。癌症病人的cfDNA中有一部分来自于肿瘤组织，这部分DNA也被成为 ctDNA(circulatingtumorDNA)，在癌症发展的早期就能检测到。线粒体DNA(chrM)在头颈 部肿瘤、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌以及食管鳞癌中表现为升高，而在胃癌、 乳腺癌、Ewing's肉瘤、肝细胞癌、非小细胞肺癌和肾细胞癌中则表现为拷贝数降低。更为 重要的是，线粒体DNA含量的变化还与某些肿瘤的恶性转化、肿瘤进展、转移以及预后密切 相关。目前已报道的对于线粒体DNA的定量PCR技术存在以下不足之处：（1)只截取chrM 的一段作为chrM整体的指标，随机误差大；（2)只能作为独立指标，无法和样品内其他DNA 含量进行对照分析；（3)采用模型拟合的方法进行定量，影响因素很多，不同模型，不同实 验流程产生的结果不一致；(4)对chrM的测量单位的定义不确定。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于分子生物学测序技术，对血液中的游离DNA进行 全基因组测序，通过识别线粒体DNA拷贝数的异常情况来判断受检者罹患癌症的风险的检 测装置。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的实施方式所提供的线粒体DNA拷贝数变异性的检 测装置包括：测序单元，其对待检者血浆样本中的游离DNA进行全基因组测序，得到待检样 本的测序结果；计算单元，其将待检样本的测序结果比对到人类参考基因组上，计算待检样 本的线粒体DNA拷贝指数；比较判断单元，其将待检样本的线粒体DNA拷贝指数与预先设定 的诊断界限值进行比较，判断待检样本是否存在线粒体DNA拷贝数变异性。
[0007] 进一步地，由于线粒体DNA含量的变化与肿瘤的恶性转化、肿瘤进展、转移以及预 后密切相关，因而比较判断单元还可进一步根据待检样本是否存在线粒体DNA拷贝数变异 性，判断待检者罹患癌症的风险。
[0008] 上述线粒体DNA拷贝数变异性的检测装置将分子生物学测序技术与生物信息分 析技术相结合，可实现对癌症的早期诊断。使用该装置进行癌症筛查时，只需抽取检测对 象的血液样本，从血浆中抽提游离的DNA作为待检样本；通过装置中的测序单元对游离DNA 进行全基因组测序、然后通过装置中的计算单元将测序结果比对到人类参考基因组上，计 算得到待检样本的线粒体DNA拷贝指数；通过比较判断单元将待检样本的线粒体DNA拷贝 指数与预先设定的诊断界限值进行比较，来判断待检样本是否存在线粒体DNA拷贝数变异 性，进而判别待检者是否处于癌症高危状态，从而实现癌症的早期无创筛查或治疗效果评 估。由于几乎所有的恶性实体瘤都存在线粒体DNA拷贝数变异，通过将分子生物学测序结 果序列比对到人类参考基因组的线粒体DNA上的测序条数情况，即可以反映线粒体DNA拷 贝数的异常情况。线粒体DNA拷贝数的异常也是判断良性和恶性肿瘤的重要指标，所以本 发明的实施方式所提供的线粒体DNA拷贝数变异性的检测装置既具备癌症的特异性（在各 类疾病中只有恶性肿瘤存在线粒体DNA拷贝数异常），也具备对各类癌症的通用性（几乎所 有的癌症都存在线粒体DNA拷贝数异常）。
[0009] -方面，作为一种对线粒体DNA拷贝数的定量装置，本发明的实施方式所提供的 该种检测装置在对线粒体DNA拷贝数的定量方式上具备以下特点：首先，对线粒体DNA的定 量检测将线粒体DNA作为整体进行计数，随机误差小，具有较高的稳定性。其次，本发明的 装置对线粒体DNA的检测方法为全基因组测序中的一个统计指标，随着研究的加深，可以 将其与癌症的各种相关基因进行更深入的相关分析，使检测结果具有横向可比性。再次，本 发明的检测装置中所使用的计算方法为精确的定量方法，只需计数，读数即可，不存在模型 拟合导致不同模型结论不一致的情况，其检测结果具有较高的准确性。
[0010] 另一方面，作为一种癌症的筛查检测装置，本发明的实施方式所提供的该种检测 装置在对癌症的早期筛查方面还具备以下特点：（1)无创：通过抽血来进行检测，对受检者 的身体没有伤害，整个检查过程几乎没有痛苦；（2)早期筛查：利用该装置能比影像诊断早 几个月发现肿瘤组织；（3)适用面广：能够发现几乎所有的实体瘤；(4)准确率和灵敏度高： 基于DNA序列水平进行检测，不易发生误诊；（5)实时监控：游离DNA(cfDNA)在体内的半衰 期为16分钟至1小时，因此本装置的检测结果还能作为肿瘤术后或治疗效果评估的实时指 标；(6)由于不同癌症的线粒体DNA拷贝数变异不一致，本发明的实施方式中所做的线粒体 DNA拷贝数还可能成为一种癌症的分型指标。
[0011] 具体地，本发明的实施方式所提供的线粒体DNA拷贝数变异性的检测装置中， 待检样本的线粒体DNA拷贝指数为：待检样本的线粒体DNA拷贝数和核内DNA拷贝数 的相对比值Mt或以Mt为单变量的单调函数值，且：Mt=nt (chrM)/len(chrM)/nt (chrN)/ len(chrN)，其中：nt(chrM)为待检样本的测序结果比对到人类参考基因组的线粒体DNA上 的测序条数，len(chrM)为人类参考基因组的线粒体DNA的长度（DNA的长度一般为取定的 染色体的bp(basepair)碱基数），nt (chrN)为待检样本的测序结果比对到人类参考基因 组的核内DNA上的测序条数，len(chrN)为人类参考基因组的核内DNA的长度。核内DNA的 选择可以为多种，例如可选择常染色体DNA、或者常染色体DNA+性染色体DNA;甚至是取一 组特定的panel，分别代表线粒体和细胞核内的DNA的拷贝数。值得补充说明的是，本发明 的实施方式所提出的上述指标，即线粒体DNA拷贝数和核内DNA拷贝数的相对比值，其单位 为1，理论上可以兼容用panel或者qPCR得到的对应数值结果。
[0012] 此外，以Mt为单变量的单调函数值例如可以为Mt的自然对数值lnMt、Mtn(n>l)等， 取决于所采用的统计方法的不同。当然，在上述对待检样本的线粒体DNA拷贝指数的计算 过程中，还可以有各种变换或替代方案，例如线粒体DNA可以选择线粒体上的一个或几个 区间作为计算指标，核内DNA也可以选择某一个或几个区间作为计算指标，均可以实现本 发明的目的。
[0013] 进一步地，本发明的实施方式所提供的线粒体DNA拷贝数变异性的检测装置中， 比较判断单元中的诊断界限值通过下述方法得出：
[0014] (1)取一组健康人群血浆中的游离DNA作为对照样本群，以测序单元相同的装置 对该对照样本群进行全基因组测序，计算每个对照样本的线粒体DNA拷贝指数，对照样本 的线粒体DNA拷贝指数为对照样本的线粒体DNA拷贝数和核内DNA拷贝数的相对比值Mh 或以 ％为单变量的单调函数值，且：MH=nH(chrM)/len(chrM)/nH(chrN)/len(chrN)，其 中：nH(chrM)为对照样本的测序结果比对到人类参考基因组的线粒体DNA上的测序条数， len(chrM)为人类参考基因组的线粒体DNA的长度，nH(chrN)为对照样本的测序结果比对 到人类参考基因组的核内DNA上的测序条数，len(chrN)为人类参考基因组的核内DNA的 长度。
[0015] (2)取一组癌症患者血浆中的游离DNA作为癌症样本群，以测序单元相同的装置 对癌症样本群进行全基因组测序，