ii)IMJ-118与阴道上皮细胞的粘附 作用。
【具体实施方式】
[0043] 以下通过具体实施例对本发明进行解释和说明，但本发明的保护范围并不局限于 此。任何人在本发明的启示下获得的与本发明相同或相似的产品，均属于本发明的保护范 围。
[0044] 菌株：詹氏乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii)IMJ_118,从我国健康妇女体内分 离获得，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.9466。
[0045] 下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0046] 下述实施例中所使用的实验材料，如无特殊说明，均为并领域常规材料，可商购获 得。
[0047] 下述实施例中所使用的实验试剂，如无特殊说明，均为本领域常规试剂，或采用本 领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。
[0048] 实施例1、詹氏乳酸杆菌菌株的分离和鉴定
[0049] -、詹氏乳酸杆菌菌株的分离
[0050] MRS培养基：蛋白胨10. 0g;牛肉膏10. 0g;酵母膏5. 0g;柠檬酸氢二铵2. 0g;葡萄 糖 20. 0g;吐温 80,1.OmL;乙酸钠（CH3C00Na? 3H20) 5. 0g;磷酸氢二钾（K2HP04 ? 3H20) 2. 0g; 硫酸镁（MgS04 ? 7H20)0. 58g;硫酸锰（MnS04 ?H20)0. 25g;蒸馏水lOOOmL;调至pH6. 2 ~ 6. 6〇
[0051] 收集了 200余例临床检测无阴道炎症状体征的健康妇女阴道分泌物样品，将样本 依次编号，接种于MRS液体培养基，37°C厌氧培养24h。每个样本随机挑选5个单菌落于2mL MRS液体培养基中培养增菌24h，并对菌落依次编号。扩增细菌用于细菌保种与DNA制备。将 分离到的数百株细菌分别进行菌种鉴定、产过氧化氢能力及与阴道上皮细胞粘附作用的检 测，把其中一株具有较强粘附作用且产过氧化氢能力较强的詹氏乳酸杆菌命名为頂J-118。
[0052] 二、詹氏乳酸杆菌菌株的鉴定
[0053] 1、形态学鉴定
[0054] 在MRS乳酸杆菌培养基平板上，上述步骤一分离得到的菌株MJ-118表现为大小 约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落边缘整齐、较湿润，大小形态稳定（图1)。
[0055] 2、生理生化特征分析
[0056] 菌株^1-118兼性厌氧，生长最适温度为37-42°0，最适口11值为5.8-6.2。根据 API细菌鉴定标准利用API50CHL培养基和API50CH试剂条（bioM^rieux,Inc.，Marcy 1 'Etoile，France)对检测菌株頂J-l18进行糖发酵反应判读检测菌株頂J-l18的生理生化 特征。API50CHL是由49种可发酵碳水化合物的API50CH试验条组成的简易培养基。以 测定菌制成悬液接种试验条的每一个小管。当培养时，由于发酵碳水化合物产酸，pH下降， 使指示剂变色。
[0057] 结果显示，菌株MJ-118可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖等多种糖。
[0058]3、16srDNA序列同源性分析
[0059] 常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株MJ-118,提取菌株的总DNA作 为基因扩增模板，采用通用引物27f:5'-AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3'，1492r: 5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'扩增细菌16SrRNA基因保守区。25yL扩增体系包 括：1XPCR反应缓冲液，200ymol/LdNTPs，上游及下游引物各0.2ymol/L，lUTaqDNA 聚合酶，11^模板0嫩。反应条件：941：预变性5111111;941：变性3〇8,551：退火4〇8,72°〇 延伸30s，共25个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物用1%凝胶电泳检测，阳性结果用27f: 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，1492r:5，-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ' 进行双向测 序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息 中心NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。
[0060] 菌株頂J-118的16srDNA的序列详见序列表中序列1。
[0061] 实施例2、詹氏乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii)IMJ-118的功能分析
[0062] 1、詹氏乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii)IMJ-118 产 11202的检测
[0063]H202标准曲线制作：首先用浓度为100mmol/L的哌嗪-N，N' -二-乙磺酸 (Piperazine_N，N_-Bis2-ethanesulfonicacid，PIPES)将 30 % (v/v)H202 (相当于 9. 128mol/L)储存液稀释成lmol/L，再用100mmol/LPIPES将lmol/LH202分别稀释成 0ymol/L、20ymol/L、40ymol/L、60ymol/L、80ymol/L、100ymol/L的工作液；然后分别 取100yL上述H202工作液与100yL浓度为20mmol/L的TMB(四甲基联苯胺）、2yL辣根 过氧化物酶（lmg/mL)混合，16°C孵育10min，测量0063(|值。最终得到H202浓度标准曲线：y =0. 0033x-0. 0496,R2= 0. 992。
[0064] 詹氏乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii)IMJ-118液体培养11202浓度检测：挑 取詹氏乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii)IMJ-118CGMCCNo. 6558 菌落，接种lmL培养 48h的菌液于10mLMRS液体培养基中，使培养液中菌株的浓度为105cfu/ml，于厌氧环境下， 37°C静置培养21h后，转换为37°C振荡培养3h，转速为220r/min，旋转半径为2. 54cm，培养 结束后，收集发酵液，12000r/min离心2min，取100yL菌液上清测量0063(|值，根据步骤1得 到的H202标准曲线，计算菌液上清中H202的浓度。实验重复三次，结果取平均值。
[0065] 结果如表1所示，詹氏乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii)IMJ-118在发酵培养 液中能够产生大量的H202，其浓度高达1159. 6yM。
[0066] 表1詹氏乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii)IMJ-118产生H202的能力检测（单 位：uM)
【主权项】
1?一株詹氏乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii)，其保藏名称为保藏号 为：CGMCC9466。
2. 权利要求1所述的詹氏乳酸杆菌IMJ-118(Lactobacillusjensenii)在制备预防和 /或治疗细菌性阴道病的产品中的用途。
3. -种菌剂，包含权利要求1所述的詹氏乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii) MJ-118。
4. 权利要求3所述的菌剂在制备预防和/或治疗细菌性阴道病的产品中的用途。
5. -种预防和/或治疗细菌性阴道病的产品，其活性成分包含权利要求1所述的詹氏 乳酸杆菌（Lactobacillusjensenii)IMJ-118。
6. -种预防和/或治疗细菌性阴道病的产品，其特征在于：活性成分是权利要求1所 述的弯曲乳酸杆菌菌株IMJ-118。
7. -种抑制致病性细菌的产品，其活性成分包含权利要求1所述的詹氏乳酸杆菌 (Lactobacillusjensenii)IMJ-118。
8. -种抑制致病性细菌的产品，其活性成分是权利要求1所述的詹氏乳酸杆菌 (Lactobacillusjensenii)IMJ-118。
9. 根据权利要求5~8任一所述的产品，还包括用于制备益生菌类药物制品的常规辅 助成分。
10. -种体外抑制致病性细菌的方法，其特征在于，使用以权利要求1所述的詹氏乳酸 杆菌（Lactobacillusjensenii)IMJ-118为活性成分的产品对体外存在的致病性细菌进行 抑制。
【专利摘要】本发明涉及詹氏乳酸杆菌及其应用，特别涉及一种用于防治细菌性阴道病的詹氏乳酸杆菌(Lactobacillus jensenii)IMJ-118。所述菌株具有较强的产生H2O2的能力，可有效抑制外来病原菌和其它条件致病菌的生长；同时又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用，保证了菌株在阴道上皮的定植。因此，本发明所提供的詹氏乳酸杆菌IMJ-118在细菌性阴道病防治方面具有一定的应用前景。CGMCC No.946620140716
【IPC分类】A61K35-747, C12R1-225, C12N1-20, A61P15-02, A61P31-04
【公开号】CN104694414
【申请号】CN201410674711
【发明人】张素华, 雷天箫, 陈晏, 李博宇
【申请人】北京百益恒源科技有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2014年11月21日