一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种病毒的检测试剂盒，特别是一种检测猫 传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 虽然Crandell和Maurer在1958年就从美国患呼吸道疾病的仔猫体中分离到猫 传染性鼻气管炎病毒（FHV-I)，但是国内却没有从猫体内分离到FHV-I的报道，只有1例 2014年在华南虎体内分离到虎源性FHV-I的报道，所以对于了解国内该病毒的感染现状、 病原特性及与疫苗毒的基因差异尤为重要。近几年，随着人们生活水平的提高，猫和犬一 样已逐渐成为人民的生活伴侣和精神慰藉的重要载体，宠物猫在上海宠物市场已占有相当 大的比例，而且这种比例呈逐年增长的趋势，所以猫的传染性疾病已引起相当的重视，而 FHV-I引起的猫的呼吸道疾病已成为宠物猫重要的传染病之一，其引起的城市公共安全问 题也日益凸显。目前，很多城市小区的流浪猫很多，且繁殖能力强，极易造成病毒的自循环， 使流浪猫成为病毒库和传染源，因此应当加强该病的研宄和防控，防止其成为家庭宠物和 观赏类猫科动物的致命杀手。
[0003] 目前，对于该病的病原学检测市场上还没有成熟的检测试剂盒和荧光定量PCR方 法，所以迫切需要建立一种猫传染性鼻气管炎病毒检测试剂盒及其检测方法，加强对该病 诊断的准确性，提高其诊疗效果。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种检测猫传染性鼻气管炎病毒 的试剂盒及方法，所述的这种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法要解决现有技术 中检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法复杂、准确性不高的技术问题。
[0005] 本发明提供了一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒，含有：
[0006] (1)特异性引物，其中上游引物FHV-IF的序列如SEQ ID NO :1所示，下游引物 FHV-IR的序列如SEQ ID NO :2所示；
[0007] (2)特异性探针FHV-lProbe，序列如SEQ ID NO :3所示，在特异性探针FHV-IProbe 的5'设计有荧光物质FAM，在特异性探针FHV-IProbe的3'设计有带有淬灭物质TAMRA。
[0008] 进一步的，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂、Taq酶、PCR缓冲 液、DNA聚合酶中的任意一种或者一种以上的组合。
[0009] 本发明还提供了采用上述的试剂盒检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下 步骤：
[0010] 1) 一个样本处理的步骤，从样本中提取DNA ;
[0011] 2) -个荧光PCR的步骤，按照检测样品数η (η=待检样品数+2)取荧光PCR试剂、 上下游引物和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用，将 阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加 入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中，荧光信号在60°C时收集，检 测通道：FAM ;
[0012] 3) -个结果判定的步骤，若样品Ct值> 35或无数值的标本为阴性；若样品Ct值 < 30的标本为FHV-I阳性样品；若30 < Ct值< 35的样本建议重做，重做结果Ct值为none 为阴性，否则为阳性。
[0013] 进一步的，荧光 PCR 反应条件：95°C，30s ;40 个循环，95°C，5s ;60°C，34s。
[0014] 进一步的，荧光PCR试剂由2XTaqMan Master Mix商品化试剂代替。
[0015] 进一步的，上述的检测方法还包括一个如下的质控标准：
[0016] (1)阴性对照的Ct值应等于none ;
[0017] (2)阳性对照的Ct值应<30,否则，此实验视为无效（Ct值应以S型曲线拐点的 循环数为准）；
[0018] (3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。
[0019] 进一步的，上游引物FHV-IF的序列如SEQ ID NO :1所示，下游引物FHV-IR的序列 如 SEQ ID NO : 2 所示。
[0020] 进一步的，特异性探针FHV-IProbe，序列如SEQ ID NO: 3所示，在探针F的5'设 计有荧光物质FAM，在探针FHV-IProbe的3'设计有带有淬灭物质TAMRA。
[0021] 本发明还提供了上述试剂盒的用途，用于从待测样品中检测猫传染性鼻气管炎病 毒。
[0022] 本发明是根据猫传染性鼻气管炎病毒（FHV-I)基因序列设计了一对特异性引物， 其作用是能够特异性扩增FHV-I的DNA片段。根据设计的引物扩增出的DNA片段设计探针， 其作用是特异性结合扩增出的DNA片段，在PCR扩增中释放FAM荧光信号，当荧光PCR仪通 过相应的通道采集荧光时，就可以特异性观察到扩增曲线，达到检测FHV-I的目的。
[0023] 本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的引物及探针针对猫传染 性鼻气管病毒DNA的样品可发生特异性扩增，而对没有猫传染性鼻气管病毒DNA的样品不 发生特异性扩增。因而所述引物和探针可良好地应用于检测猫传染性鼻气管病毒，并且具 有良好的再现性、特异性好、灵敏度高、时间短。
【附图说明】
[0024] 图1是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之一，显示了 TaqMAN探针一端连 接发光基团，一端连接淬灭基团，并且连接的DM链能够与特异性DNA目的片段结合。
[0025] 图2是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之二，显示了一对特异性引物在 TaqDNA聚合酶作用下一方面进行DNA片段的合成，当到达探针结合位置时，它同时发挥限 制性酶切作用，将探针中连接发光基团和淬灭基团的DNA链切断，释放发光基团。
[0026] 图3是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之三，显示了发光基团游离在反应 体系中时，受到激发就可以发出荧光，并被仪器收集到，形成扩增曲线，达到检测目的。
[0027] 图4是荧光PCR图，为猫传染性鼻气管炎病毒检测方法的特异性试验，其中呈S型 的曲线为FHV-I阳性的DNA样本，其余样本均为阴性，表明该试剂盒特异性好。
[0028] 图5是荧光PCR图，为猫传染性鼻气管炎病毒检测方法的敏感性试验，其中，5条 呈S型曲线的样本为FHV-I阳性DNA，其浓度分别为0· 75ng/ μ L、75pg/ μ L、7. 5pg/ μ L、 0. 75pg/ μ L、75fg/ μ L和7. 5fg/ μ L。通过6个浓度梯度DNA的荧光PCR反应，结果表明试 剂盒对FHV-IDNA最低检测浓度为75fg/ μ L。
[0029] 图6是荧光PCR图，为猫传染性鼻气管炎病毒检测方法在测定标准曲线过程中，三 列10倍梯度稀释的阳性样品的扩增曲线，图中可以看出在同一稀释度时S型曲线也是一致 的，表明该方法重复性好，不同稀释度之间S型曲线出现的时间间隔也是一致的，表明该方 法稳定性好。
[0030] 图7是标准曲线图，FHV-I样品反应效率达到107%，在90%~110%之间，表明该 方法反应效率较好；R 2值为0. 9965,介于0. 99和1之间，表明该方法可信度较高；重复性测 试结果表明，每个浓度DNA扩增所得Ct值的标准偏差（SD)值介于0. 086至0. 173之间，在 可接受范围内。
【具体实施方式】
[0031] 下列实施例旨在进一步举例描述发明，而不是以任何方式限制发明，在不背离本 发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或 改变都将落入本发明的待批权利范围之内。
[0032] 实施例1试剂盒组成
[0033] 实时荧光PCR反应体系为25 μ L，包含2 X TaqMan Master Mix 12. 5 μ L，上下游引 物各0· 5 μ L(IOyM)，探针1 μ L(IOyM)，5 μ L模板DNA，用去离子水补足至25 μ L。
[0034] 上游引物 FHV-IF :5'-ACGCTACAATTATACTCAAGCCAGAA-3'（SEQ ID NO :1);
[0035] 下游引物 FHV-IR :5' -TCAGCTGTTATCTTCGGATCCA-3'（SEQ ID NO :2)。
[0036] 探