酸的3'末端。杂交后的芯片在经过 清洗后使用芯片扫描仪扫描，根据杂交结果分析细菌在不同培养体系基因表达差异。具体 通过以下步骤实现：
[0039] (1)海洋黄杆菌（Gramella flavus)JLT2011RNA的提取、定量和质检过柱纯化后 的RNA用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。
[0040] RNA纯度：A260/280彡1. 80,符合表达谱芯片实验要求。
[0041] RNA总量：总量多1 yg，满足表达谱芯片实验要求。
[0042] RNA完整性：经甲醛变性胶电泳检测，RNA样品电泳条带清晰，28S:18S rRNA条 带
[0043] 亮度大于或接近2 : 1，质量符合表达谱芯片实验要求。
[0044] (2)对海洋黄杆菌（Gramella flavus) JLT2011RNA进行荧光标记（晶芯lglcRNA扩 增标记试剂盒）
[0045] a)反转录合成lst-strand cDNA :以TotalRNA或mRNA起始，含有T7启动子序列 的 T701igo(dT)Primer 为引物，使用 CbcScript 酶合成 lst-strand cDNA。
[0046] b)合成2nd_strand cDNA :用RNase H将杂合链中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段为引物延伸，合成2nd_strand cDNA，并纯化双链cDNA。
[0047] c)体外转录合成cRNA :以cDNA为模板，利用I7Enzyme Mix合成cRNA ;然后用RNA Clean-up Kit (MN)纯化。
[0048] d)随机引物反转录：取5ug cRNA，用CbcScript II酶，Random Prime进行反转录， 反转录产物用 PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化。
[0049] e) cDNA用KLENOW酶标记：取上述反转录产物，以Random Primer为引物进 行KLEN0W酶标记标记产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化，纯化后抽干。 (Cy5-dCTP or Cy3-dCTP(GE Healthcare Cat. No. PA 55021/PA53021)。
[0050] (3)杂交与清洗：标记的DNA溶于杂交液中（2X GEx Hyb Buffer(HI-RPM)，25% 甲酰胺），于45°C杂交过夜。杂交结束后，先在42°C左右含0. 2% SDS，2XSSC的液体中洗 5min，而后在0. 2XSSC中室温洗5min。玻片甩干后即可用于扫描。
[0051] (4)芯片扫描：芯片用Agilent G2565CA Microarray Scanner进行扫描，得到杂 交图片。
[0052] (5)芯片图像的采集和数据分析：焚光信号值提取：采用Feature Extraction图 像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号。
[0053] (6)差异基因筛选：将原始数据输入到GeneSpringGX软件中，采用percentile shift方法对信号值进行归一化处理。然后用Absolute Fold change彡2,同时Flag标记 为Detected的标准进彳丁差异基因筛选。
[0054] Agilent G2565CA Microarray Scanner扫描的杂交图片参见图1。在图1中，a~ g 代表 Pectin, Xylan, Glucose,其中 Pectin 和 Xylan是3 组平行，Glucose是2 组平行。
[0055] 本发明基因芯片结合核酸杂交的特异性，囊括了细菌的全部基因序列，可以检测 海洋细菌在不同培养体系基因表达差异。
[0056] 为了比较海洋黄杆菌（Gramella flavus)JLT2011在不同的培养体系下，利用基因 芯片寻找细菌基因表达差异，探索与海洋黄杆菌（Gramella flavus)JLT2011利用浮游植物 多糖差异及分子机制，采用以下方法：
[0057] 用海洋细菌设计的特定基因芯片对海洋黄杆菌（Gramella flavus)JLT2011在不 同的培养体系，分为对照组和实验组，其中Glucose为对照组，Xylan，Pectin为实验组， 进行差异基因表达分析。
[0058] 结果：基因芯片检测分析发现，如实验组Pectin样本比对照组Glucose样本有差 异表达基因948个，其中308个基因显著上调，640个基因显著下调（差异均在2倍以上）； 如实验组Pectin样本对比实验组Xylan其中478个基因显著上调，956个基因显著下调（差 异均在2倍以上）；如实验组Xylan样本比对照组Glucose样本有差异表达基因948个，其 中750个基因显著上调，484个基因显著下调（差异均在2倍以上）。说明不同浮游植物多 糖碳源基因表达存在显著差异。
【主权项】
1. 海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 菌株高通量检测基因芯片设计； 2) 将海洋黄杆菌（Gramella flavus)JLT2011培养后提取核糖核酸（RNA)，将荧光素标 记到样品核糖核酸的3'末端，杂交后的芯片在经过清洗后使用芯片扫描仪扫描，根据杂交 结果分析海洋黄杆菌（Gramella flavus)JLT2011在不同培养体系基因表达差异，具体方法 如下： (1) 海洋黄杆菌（Gramella flavus)JLT2011 RNA的提取、定量和质检过柱纯化后的 RNA用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检； RNA纯度：A260/280多1. 80,符合表达谱芯片实验要求； RNA总量：总量彡1 μ g，满足表达谱芯片实验要求； RNA完整性：经甲醛变性胶电泳检测，RNA样品电泳条带清晰，28S : 18S rRNA条带亮 度大于或接近2 : 1，质量符合表达谱芯片实验要求； (2) 对海洋黄杆菌（Gramella flavus)JLT2011 RNA进行荧光标记（晶芯?cRNA扩增 标记试剂盒） a) 反转录合成lst-strand cDNA :以TotalRNA或mRNA起始，含有T7启动子序列的 T701igo(dT)Primer 为引物，使用 CbcScript 酶合成 lst-strand cDNA ; b) 合成2nd_strand cDNA:用RNase H将杂合链中的RNA切成短片段，DNA Polymerase 以RNA短片段为引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并纯化双链cDNA ; c) 体外转录合成cRNA :以cDNA为模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA ;然后用RNA Clean-up Kit(MN)纯化； d) 随机引物反转录：取5ug cRNA，用CbcScript II酶，Random Prime进行反转录，反转 录产物用 PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化； e) cDNA用KLENOW酶标记：取反转录产物，以Random Primer为引物进行KLENOW酶 标记标记产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化，纯化后抽干；（Cy5_dCTP or Cy3-dCTP(GE Healthcare Cat. No. PA 55021/PA53021)； (3) 杂交与清洗：标记的DNA溶于杂交液中，于45°C杂交过夜，杂交结束后，先在42°C 左右含0. 2% SDS，2XSSC的液体中洗5min，而后在0. 2XSSC中室温洗5min，玻片甩干后即 可用于扫描；所述杂交液为2X GEx Hyb Buffer (HI-RPM)，25 %甲酰胺； (4) 芯片扫描：芯片用Agilent G2565CA Microarray Scanner进行扫描，得到杂交图 片； (5) 芯片图像的采集和数据分析：荧光信号值提取：采用Feature Extraction图像分 析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号； (6) 差异基因筛选：将原始数据输入到GeneSpringGX软件中，采用percentile shift 方法对信号值进行归一化处理，然后用Absolute Fold change彡2,同时Flag标记为 Detected的标准进行差异基因筛选。
2. 如权利要求1所述海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法，其特征在 于在步骤1)中，所述菌株高通量检测基因芯片设计的具体方法为：利用Agilent eArray进 行编码基因的特异性探针设计，以海洋黄杆菌（Gramella flavuS)JLT2011的编码基因为扩 增靶标，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列。
【专利摘要】海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法，涉及分子检测。所述海洋黄杆菌为(Gramella flavus)JLT2011，保藏编号：CGMCC No.1.12375。检测方法：1)菌株高通量检测基因芯片设计；2)将海洋黄杆菌培养后提取核糖核酸，将荧光素标记到样品核糖核酸的3’末端，杂交后的芯片在经过清洗后使用芯片扫描仪扫描，根据杂交结果分析海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异，具体方法如下：海洋黄杆菌RNA的提取、定量和质检过柱纯化后的RNA用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检；对海洋黄杆菌RNA进行荧光标记；杂交与清洗；芯片扫描；芯片图像的采集和数据分析；差异基因筛选。CGMCC No. 1.1237520141029
【IPC分类】C12Q1-68, C12R1-20
【公开号】CN104745717
【申请号】CN201510196649
【发明人】汤凯, 林颖芳, 杨玉洁, 林丹
【申请人】厦门大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月23日