一种与原发性肝细胞癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及原发性肝细胞癌辅助诊断相关的SNP 标志物及其应用。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC)约占其85%。据2012年国际癌症研宄署（IARC)估计，全球肿瘤发病1410 万人，其中肝癌新发病人数达到78. 25万，死亡病例达到74. 55万，其中有50%发生在中国。 据中国国家癌症中心2014年收集的全国2011年肿瘤发病和死亡数据的分析报告，我国新 发肝癌病例约35. 56万，位居我国所有恶性肿瘤的第四位；死亡病例约32. 24万，位居全部 癌症死亡病例第二位。因此，肝癌是严重危害我国人民生命健康的最主要癌症之一，是亟需 解决的重大公共卫生问题。
[0003] 肝癌的发生是一个多因素、多阶段的过程，主要环境危险因素包括慢性肝炎病毒 (HBV/HCV)感染、饮食摄入黄曲霉毒素和饮水中的微囊藻毒素等。其中，HBV/HCV导致的慢 性肝炎病毒感染被认为是肝癌发生最为重要的危险因素，与全球75%的肝癌有关，在发展 中国家甚至达到85%。其他危险因素如黄曲霉毒素的摄入等，单独存在时影响较小，其作用 机制可能是与病毒感染共同参与肝癌的发生。在这两种病毒中，HBV感染更有普遍性，除日 本之外（主要是HCV感染），HBV感染流行程度基本与全球肝癌发病的地理分布一致。在中 国，HBV感染也是首要的危险因素，但HCV的作用同样不可忽视，尤其当合并感染时，危险度 的加成更为显著。在中国台湾地区，HBV疫苗接种计划早在1984年就开始实行，对于肝癌 发病率的影响已经初步显现。江苏启东地区作为一个传统的肝癌高发区，近年来通过防治 肝炎、管粮防霉和改良饮水等综合措施，肝癌在青少年一代开始显示下降的趋势，但疫苗等 措施作用的真正体现可能还需要10-20年。
[0004] 然而，相同的环境危险因素暴露或HBV感染携带者中，仅有少数个体最终发生肝 癌，这说明不同个体对环境暴露的反应存在不同的易感性，这种易感性目前被认为是由个 体的遗传因素所决定。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)是指在 基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最 常见的一种。SNP的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗 等因素的不同反应性，因此SNP可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要 遗传基础。利用疾病易感的SNP谱预测疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应 用前景，而且通过SNP预测谱的构建，还可以实现中国古语中"上医治未病"的理想，对疾病 作出前瞻性的"基因诊断"。近年来，利用SNP预测疾病的发生发展已经成为临床和科研工 作者的研宄热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病预测上的应用价值已初见端倪。
[0005] 然而，目前还没有将SNP应用肝癌诊断的报道，若能筛选出肝癌易感的SNP作为生 物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国肝癌诊断现状必将是一次有力的推动，也为其 药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与肝癌辅助诊断相关的SNP标志物 及其应用。
[0007] 本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。
[0008] 本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性延伸引物。
[0009] 本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物和特异性延伸引物 在制备肝癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[0010] 本发明第五个目的是提供肝癌辅助诊断试剂盒。
[0011] 发明人通过分离和研宄肝癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的单 核苷酸多态性，寻找一组与肝癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床 应用的肝癌辅助诊断试剂盒，为肝癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价 值的新型小分子药物提供数据支持。
[0012] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0013] 一种肝癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs7574865、 rsl012068、rsl7401966、rs2596542、rs455804、rs9272105、rs9275319 和 rs9275572。
[0014] 所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性引物。
[0015] 所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性引物为：
[0016] rsl0212068 的引物序列为 SEQ ID No :1、SEQ ID No :2 和 SEQ ID NO :3 ;
[0017] rs455804 的引物序列为 SEQ ID No :4、SEQ ID No :5 和 SEQ ID NO :6 ;
[0018] rs9275319 的引物序列为 SEQ ID No :7、SEQ ID No :8 和 SEQ ID NO :9 ;
[0019] rs2596542 的引物序列为 SEQ ID No :10、SEQ ID No :11 和 SEQ ID NO :12 ;
[0020] rs9272105 的引物序列为 SEQ ID No :13、SEQ ID No :14 和 SEQ ID NO :15 ;
[0021] rs9275572 的引物序列为 SEQ ID No :16、SEQ ID No :17 和 SEQ ID NO :18 ;
[0022] rsl7401966 的引物序列为 SEQ ID No :19、SEQ ID No :20和SEQ ID NO :21 ;
[0023] rs7574865的引物序列为SEQ ID No :22、SEQ ID No :23和SEQ ID NO :24。
[0024] 所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP 混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0025] 具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：（1)建立统一标准的标本库和数据 库：以标准操作程序（SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床 资料。⑵基因型检测：选择肝癌病例，与肝癌病例年龄、性别匹配的对照，利用高密度SNP 芯片，在全基因组范围内找出与肝癌相关的SNP。（3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步采用 Sequenom MassARRAY基因分型平台进行检测，验证其应用于临床诊断的可重复性。（4)肝 癌辅助诊断试剂盒的研制：根据肝癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP 开发SNP辅助诊断试剂盒。
[0026] 本发明人以标准操作程序（SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料等，并采用了 Illumina Human 0mniExpressl2vl芯片进行全基因组扫描， Sequenome基因分型进行单个位点的检测等。
[0027] 具体来说研宄的实验方法主要包括以下几个部分：
[0028] 1.研宄样本的选择
[0029] (1)经病理学明确诊断的肝癌病例；
[0030] (2)与病例年龄、性别匹配的对照；
[0031] 本研宄共采用7323例符合标准的样本进行研宄。
[0032] 2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/y 1 DNA，纯度（紫外2600D与2800D比值）在1. 6-2. 0。
[0033] 3. Human OmniExpressl2vl 芯片检测
[0034] (1)取受试者全基因组DNA样本；
[0035] (2)在Human OmniExpressl2vl芯片（购于美国Illumina公司，下同）上进行全 基因组扫描；
[0036] (3)检测并比较各基因型在肝癌病例与健康对照中的分别差异。
[0037] 4?单个SNP的Sequenome基因分型
[0038] (1)取受试者DNA样本；
[0039] (2)设计单个SNP的特异性引物；
[0040] (3)进行PCR反应及延伸反应；
[0041] (4)检测并比较肝癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
[0042] 5.诊断试剂盒制备方法
[0043] Human 0mniExpressl2vl芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定肝癌病例 与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为肝癌诊断的指标。最后筛选出的与肝 癌发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒（rs7574865、rsl012068、rsl7401966、rs2596542、 rs455804、rs9272105、rs9275319和rs9275572)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引 物，以及Taq酶、dNTP等试剂。
[0044] 6.统计分析方法
[0045] 运用卡方检验（用于分类变量）或者student t检验（用于连续性变量）比较人 口学特征等在研宄对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关 联分析。
[0046] 为了进一步研宄这8个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一 个数学公式，综合考虑每个SNP与肝癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们 对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型=" 0 "，杂合型=" 1"，变异纯合型=" 2 "，以 单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研 宄研宄对照确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值=(1. 19Xrs7574865 的评分）+ (l. 31Xrsl012068 的评分）+ (l. 22Xrsl7401966 的评分）+ (l. 25Xrs2596542 的 评分）+