一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及柑橘贮藏及分子生物学领域，具体涉及一种与柑橘果实贮藏寿命相关 的分子标记引物及应用。
【背景技术】
[0002] 柑橘在世界范围内广泛栽培，已经成为全球第一大水果。柑橘产量高并且成熟期 相对集中，为保证市场供应的平衡，柑橘果实采后贮藏就显得十分重要。然而，柑橘贮藏期 间因环境和病害的影响导致大量果实在出售前就已经失去商品价值，导致大量经济损失。 若能够开发表征柑橘贮藏寿命的生物标记，就能够对果实在贮藏期间的生理状态进行监 测，让果实在其风味最佳时期上市，不仅可以减少经济损失，又可以使消费者尝到鲜美的果 实。
[0003] 生物标记指一个可以预测一些生物状态或是生物条件的特定指标，如血液中的 小分子。目前，关于生物标记的研宄在医学、细胞生物学、地质和天体生物学中广泛应用， 特别是在医学研宄中的癌症诊断和治疗方面。例如，在临床医学中，生物标记被细分为筛 选标记、诊断标记、预诊标记、预测标记和监控标记，他们分别用于分析癌症的不同阶段 (Fan Zhang and Jake Y. Chen,2013, Data Mining Methods in Omics-Based Biomarker Discovery)。在植物的研宄中，生物标记更多的是应用于植物采前发育阶段的研宄 (Juanjuan Zhang 2010, Agudelo-Romero, Erban et al. 2013)或是比较生物逆境和非生物 逆境对生物造成的不同影响（Ramakrishna 2014)。目前还没有在植物果实采后贮藏阶段运 用生物标记对果实的生理状态进行预测和鉴定的研宄。
[0004] 柑橘果实采收以后脱离了树体，形成了相对独立的代谢个体。由于能量库源关系 的改变，会发生一系列的生理生化变化，特别是对果实采后品质和风味影响较大的糖酸、酚 类、萜类物质。但果实在逐渐衰老的过程中，对果实的风味起主要作用的柠檬酸和葡萄糖等 物质的变化呈现出一种波动趋势（Xiaohua Sun 2013)，因此这些物质并不能明显区分柑橘 果实在采后贮藏过程中的生理状态，也无法用主要有机酸和糖类作为预测柑橘果实贮藏寿 命的生物标记。然而，运用传统的基因表达分析手段，无法快速的大规模的检测其他微量物 质的变化。
[0005] 随着基因芯片技术和二代测序技术的发展，柑橘基因组草图已经完成（Xu，Chen et al. 2013)，使得在全基因组水平上检测柑橘在采收贮藏过程中的基因的表达趋势变化 成为可能。本发明运用时间序列的芯片数据经过分类处理可以在全基因组水平将柑橘采后 贮藏过程分为三个生理阶段，并筛选出能够表征这三个不同生理阶段的一个生物标记。
【发明内容】
[0006] 本发明是通过对温州蜜柑采后贮藏0-50d过程中基因中芯片数据的分析，筛选 出能够预测柑橘果实贮藏寿命的生物标记谷胱甘肽S-转移酶（Cit. 15371. 1. Sl_at)，在 此基因序列的基础上提供了一种基于谷胱甘肽S-转移酶基因序列的qRT-PCR的引物： CGGGATGGATGCCAACAA ；GCCTGGCCTTTTCCCATAAT 〇
[0007] 本发明的另一个目的在于提供了基于谷胱甘肽S-转移酶基因序列的qRT-PCR的 引物在预测柑橘贮藏寿命中的应用，特别适用于预测温州蜜柑贮藏寿命。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0009] 本发明运用R软件mixOmics包对温州蜜柑采后贮藏0-50d的基因芯片数据进行 主成分分析（PCA)和最小二乘法判别分析（PLS-DA)，获得了谷胱甘肽S-转移酶基因与柑橘 的贮藏寿命相关。
[0010] 因此根据谷胱甘肽S-转移酶基因设计相关的qRT-PCR引物，可根据谷胱甘肽 S-转移酶基因的表达量判断某一批柑橘果实的贮藏寿命。
[0011] 具体的，本发明涉及的引物及判定方式如下：
[0012] 基于谷胱甘肽S-转移酶基因设计qRT-PCR的引物：CGGGATGGATGCCAACAA ; GCCTGGCCTTTTCCCATAAT ;进行qRT-PCR反应，可判断柑橘的贮藏寿命。
[0013] 本发明特别对温州蜜柑进行了检测，结果显示：
[0014] 在采后贮藏初期谷胱甘肽S-转移酶基因表达量范围在0.8-1. 0,风味最佳期谷胱 甘肽S-转移酶基因表达量范围在0. 7-0. 8,采后贮藏末期表达量低于0. 7。
[0015] 本发明中果实采后贮藏从温州蜜柑果实套袋当天计算，柑橘果实采后贮藏阶段实 际上是一个果实成熟衰老的复杂过程，在果实采后贮藏阶段品质和风味会发生一系列复 杂变化，如主要糖类的波动性升高，有机酸的波动性降低。在贮藏过程中温州蜜柑的糖酸比 将直接影响果实的风味，本发明将温州蜜柑贮藏过程中糖酸比处于适宜水平的阶段定义为 风味最佳期，温州蜜柑套袋后适应贮藏环境的时期称为采后贮藏初期，温州蜜柑果实逐渐 发老失水阶段称为米后1C臧末期。
[0016] 本领域技术人员，可利用本发明提供的分子标记引物，根据不同柑橘品种中谷胱 甘肽S-转移酶基因表达的变化情况，来预测柑橘的贮藏寿命。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0018] 1)明确标记基因：现有关于柑橘采后衰老的研宄，很大程度上只是做出相关性结 论，并没有指出具体基因能够用来表征温州蜜柑采后贮藏的生理阶段，本发明明确指出标 记基因谷胱甘肽S-转移酶（Cit. 15371. 1. Sl_at)。
[0019] 2)应用前景广：对温州蜜柑采后贮藏阶段贮藏寿命的预测，能够推动温州蜜柑在 风味最佳时期销售，不仅为果实的最佳销售时期提供了很好的理论依据，而且能为贮藏量 达千吨级的企业作好风险预测。
【附图说明】
[0020] 图1为PCA分析将温州蜜柑采后贮藏时期划分为3个不同阶段（生理状态）示意 图。
[0021] 图2为PLS-DA分析将温州蜜柑采后贮藏时期划分为3个不同阶段（生理状态） 示意图。
[0022] 图3为实施例1中qRT-PCR验证候选生物标记的表达趋势示意图。
[0023] 图4为实施例2中qRT-PCR验证谷胱甘肽S-转移酶（Cit. 15371. 1. Sl_at)的表 达趋势示意图。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 :
[0025] 与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物的获得：
[0026] ①对0-50d柑橘基因芯片数据运用R中bioconductor软件包预处理后，进行 biweight归一化，以0. 5为阈值筛选出5232个差异基因；
[0027]②对差异基因进行无监督的主成分分析（PCA)，可以将柑橘采后贮藏的生理状态 初步划分为三个（图1)。
[0028] ③根据上述初步分类再运用有监督的机器学习方法最小二乘法（PLS-DA)对温州 蜜柑果实采后生理状态进行细分（图2)。
[0029] ④依据PLS-DA模型中变量重要性（VIP>1. 5)可筛选出外层包膜蛋白 (Cit. 19708. 1. Sl_s_at，VIP = 1. 505351997)、葡萄糖磷酸变位酶（Cit. 11441. 1. Sl_at， VIP = 1. 502331574)、谷胱甘肽 S-转移酶（Cit. 15371. 1. Sl_at，VIP = 1. 500944055) 3 个 基因在温州蜜柑整个贮藏过程中具有明显表达趋势的基因。
[0030] ⑤供试用的柑橘果实为温州蜜柑，采摘后去除病虫果及烂果，放于自然条件下发 汗2天后，套袋贮藏于002实验室。每隔2至5天进行果肉取样，，直到果实90%失去商品 价值。取样时间如图3,共取样8次。提取样品RNA，用液氮对进行速冻并置于-80°C冰箱 中保存，备用。根据上述分析设计筛选出的外层包膜蛋白（Cit. 19708. 1. Sl_s_at，VIP = 1. 505351997)、葡萄糖磷酸变位酶（Cit. 11441. 1. Sl_at，VIP = 1. 502331574)、谷胱甘肽 S_ 转移酶（Cit. 15371. 1. Sl_at，VIP = 1. 500944055, SEQ ID NO. 1 所示）3 个基因的引物 (表1)，进行qRT-PCR定量验证。
[0031] 表 1
【主权项】
1. 一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物，其特征在于： CGGGATGGATGCCAACAA ；GCCTGGCCTTTTCCCATAAT〇
2. 权利要求1所述的引物在预测柑橘贮藏寿命中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，所述的柑橘为温州蜜柑。
4. 根据权利要求3所述的应用，具体步骤为： 利用引物CGGGATGGATGCCAACAA ;GCCTGGCCTTITCCCATAAT进行qRT-PCR反应，扩增产物 相对表达量在0. 8-1. O为贮藏初期；在0. 7-0. 8为风味最佳期；低于0. 7为采后贮藏末期。
【专利摘要】本发明公开了一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物及应用。该标记基因在温州蜜柑采后贮藏期间表达量有明显阶段性变化，其表达量的高低直接与柑橘果实抗逆性和抗氧化性相关。利用该分子标记引物：CGGGATGGATGCCAACAA；GCCTGGCCTTTTCCCATAAT，获得谷胱甘肽S-转移酶基因的相对表达量，可判定其在贮藏过程中的贮藏寿命。本发明的提供的引物能够准确指示柑橘贮藏期间的生理状态，为果实的最佳销售时期提供了很好的理论依据，并能为贮藏量达千吨级的企业作好风险预测。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104745712
【申请号】CN201510185393
【发明人】程运江, 孙力, 何义仲, 丁毓端
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月20日