双孔装置的制造方法
【专利说明】双孔装置
[0001] 本申请是申请日为2012年07月18日、专利号为化201280005639. 8、发明名称为 "双孔装置"的发明专利的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请根据3抓SC§ 119(e)要求2011年07月20日提交的序列号为61/572, 843 的美国临时申请的权益，并通过引用其内容全部纳入本申请。
【背景技术】
[0004] 纳米孔（nanopore)是在脂膜中自然形成的作为蛋白质通道（生物孔）的、或是通 过在固态基体中钻孔或蚀刻工程改造（固态孔）的纳米级通路。当该样的纳米孔合并入包 括两个由纳米孔隔开的室的纳米装置时，可利用灵敏的膜片错放大器施加跨膜电压，并测 量通过该孔的离子电流。
[0005] 纳米孔为廉价的全基因组DNA测序提供很大的希望。在该方面，可W通过电泳捕 获单个DNA分子并驱使其通过孔，检测到的各捕获事件是离子电流的瞬时变化。然后当DNA 通过孔通路时，可W从变化的离子电流记录内的图谱、或从纳米孔内或附近的一些其他辅 助传感器推测出DNA分子序列。
[0006] 原则上，纳米孔测序器在测序操作过程中无需扩增样品、使用酶和用于催化的试 剂，也无需用于检测测序进程的光学器件，而其中一些或全部器件是常规合成测序方法所 必需的。
[0007] 纳米孔传感器是纯粹的电学装置，而且可W检测其浓度/体积不大于从血液或唾 液样本中可得浓度/体积的DNA。此外，纳米孔有望大大提高所测序DNA的阅读长度，从450 个碱基到大于10000个碱基。
[0008] 对于纳米孔测序有两个原理障碍；（1)对于从头测序缺乏足够的灵敏度来精确确 定核酸中各核巧酸身份（单核巧酸灵敏度缺乏）；和（2)缺乏在感知期间调节各核巧酸单 元通过纳米孔的传输率的能力。虽然许多研究小组正研发和改善纳米孔W解决障碍1，但没 有不设及使用酶或光学器件的方法来解决障碍2,两者只能在专口的纳米孔技术中起作用， 并与纯粹的电学方法相比，复杂性和成本更高。
[0009] 概述
[0010] 在一实施例中，提供一种装置，包括上室，中间室和下室，其中，所述上室通过第一 孔与所述中间室连通，所述中间室通过第二孔与所述下室连通，其中，所述第一孔和第二孔 的直径约1纳米到约100纳米，彼此间隔约10纳米至约1000纳米，且其中各室包括用于连 接电源的电极。
[0011] 在一方面，所述第一和第二孔大体上是同轴的。
[0012] 在一方面，所述装置包括选自下组的材料；娃、氮化娃、二氧化娃、石墨締、碳纳米 管、Ti〇2、册〇2、Al2〇3、金属层、玻璃、生物纳米孔、具有生物孔嵌入的膜、及它们的组合。
[0013] 在一方面，所述第一孔和第二孔约0. 3纳米至约100纳米深。
[0014]在一方面，所述电源配置用于在所述上室和所述中间室之间提供第一电压，和在 所述中间室和所述下室之间提供第二电压，且其中所述第一电压和第二电压独立可调。
[0015] 在一方面，所述电源包括电压错系统或膜片错系统W生成各第一和第二电压。在 一方面，所述中间室调整为相对于两电压接地。在一方面，所述中间室包括介质W便在各孔 和中间室内的电极之间提供导电性。
[0016] 在一些方面，所述电源，如电压错系统或膜片错系统，进一步配置用于测量通过各 孔的离子电流。
[0017] 另一实施例提供一种装置，包括上室，中间室和下室；W及在各室内的电极，其中 所述上室通过第一孔与所述中间室连通，所述中间室通过第二孔与所述下室连通，其中，所 述第一孔和第二孔的直径约1纳米到约100纳米，彼此间隔约10纳米至约1000纳米；所述 电极用于连接电压错系统或膜片错系统W便在各孔施加电压和测量通过各孔的离子电流， 其中所述中间室内的电极连接到两电压错或膜片错系统的共同地线（commonground)。
[0018] 在一个实施例中，还提供一种用于控制荷电聚合物跨孔运动的方法，包括；(a)将 包括荷电聚合物的样品加载在上述任一实施例中的装置的上室、中间室或下室之一内，其 中所述装置连接到电压错或膜片错系统W便在所述上室和所述中间室之间提供第一电压 和在所述中间室和所述下室之间提供第二电压；化）设置初始第一电压和初始第二电压W 使所述聚合物在诸室之间移动，从而定位通过第一和第二孔的聚合物；W及（C)调整第一 电压和第二电压，W致两电压产生作用力W便在受控条件下牵拉所述荷电聚合物离开所述 中间室，从而所述荷电聚合物在一个方向上并W可控的方式移动通过两个孔，其中，两电压 的量值不同。
[0019] 在一方面，通过第一电压或第二电压或两电压的主动控制或反馈控制建立可控的 传递方式，其中任一电压或两电压作为第一或第二或两离子电流测量值的反馈函数。非限 定性的例子包括将第二电压保持恒定，并使用第二离子电流作为用于第一电压的反馈或主 动控制的反馈，W便在任一方向上可控传送荷电聚合物。因此，在一方面，基于所测量的通 过所述第二孔的离子电流调整所述第一电压。
[0020] 在一方面，将样品加载到上室中，设置初始第一电压将荷电聚合物从上室牵拉至 中间室，设置初始第二电压将聚合物从中间室牵拉至下室。
[0021] 在另一方面，将样品加载到中间室中，设置初始第一电压将荷电聚合物从中间室 牵拉至上室，设置初始第二电压将荷电聚合物从中间室牵拉至下室。
[0022] 在一方面，荷电聚合物为多核巧酸或多肤。在一方面，荷电聚合物是多核巧酸，例 如，但不限于，双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、双链RNA(dsRNA)、单链RNA(ssRNA)或 DNA-RNA杂交体。
[0023] 在一方面，在步骤（C)，调整的第一电压和第二电压在量值上是两电压间差异的约 10倍至约10000倍。
[0024] 在一方面，所述方法进一步包括当聚合物的单体单元穿过其中一孔时，通过测量 穿过该孔的离子电流来识别该单体单元。在一方面，所述单体单元是核巧酸。在另一方面， 所述单体单元是核巧酸对。在一些方面，单核巧酸和核巧酸对可W在一个分子中检测。例 如，该样的分子可W在较长和其他单链多核巧酸中具有双链体区段，其中所述双链体区段 部分或全部通过沃森克里克互补碱基配对形成。
[0025] 在一方面，单体结合到分子，如DNA结合蛋白或纳米粒子。DNA结合蛋白的非限制 实例包括RecA和序列特异性DM结合蛋白，如瞻菌体A阻遏物、NF-kB和p53。纳米粒子 的非限制性例子包括量子点和巧光标记物。
[0026] 在一方面，聚合物在其一末端附着于固体支持物，如珠。
[0027] 还有的另一实施例提供用于检测多核巧酸序列的方法，包括；(a)将包括多核巧 酸的样品加载在任一上述实施例所述装置的上室内，其中所述装置连接到电压错或膜片错 系统W便在所述上室和所述中间室之间提供第一电压和在所述中间室和所述下室之间提 供第二电压，其中所述多核巧酸任选在其一末端连接于固体支持物；化）设定初始第一电 压和初始第二电压，W致所述多核巧酸从所述上室移动到所述中间室，从所述中间室移动 到所述下室，从而定位穿过所述第一孔和第二孔的所述聚合物；（C)调节所述第一电压和 所述第二电压W致两电压产生作用力W便在可控条件下牵拉所述多核巧酸离开所述中间 室，其中所述两电压在量值上不同，W致所述多核巧酸在一个方向上W可控方式移动穿过 两孔；和（d)当所述核巧酸穿过孔之一时，通过测量穿过该孔的离子电流识别穿过该孔的 多核巧酸的各核巧酸。
[0028] 附图简要描述
[0029] 附图仅通过举例的方式描述提供的实施例，其中：
[0030] 图1讯-(III)示出两孔（双孔）装置。讯用于各孔独立电压控制（V。V2)和电 流测量（I。12)的双孔巧片和双放大器电子配置的示意图。除了共同孔，诸室（A-C)在体 积上隔开。可用的巧片参数是孔间距离10-500纳米，膜厚度0. 3-50纳米，孔径1-100纳 米。（II)电学上，通过构建最大程度降低所有接入电阻W便有效去禪Ii和12的装置，Vi 和V2主要在各纳米孔电阻上。（III)竞争电压（competingvoltage)将用于控制，藍色箭 头显示各电压作用力（voltage化rce)的方向。假设孔隙具有相同电压力影响，用IVII= IV2I+ 5V，调节5V值〉0(<0)用于在Vi(V2)方向可调谐的运动。实际上，对于给定的两孔 巧片，虽然Vi=V2时各孔的电压诱导力并不会完全相同，但校准实验可确定产生相同牵拉 力所需的电压偏差，然后可利用围绕该偏差的变化进行方向控制；和
[0031] 图2示出具有室A、室B和室C的两孔壳体装置的外部视图，各室具有用于流体进 入和样本加载的通路。双孔巧片放置在两密封垫之间，壳体装置的各部分具有各密封垫部， 并且两部分绕较链（中间顶部）旋转W在巧片周围打开和关闭所述壳体。
[0032] 某些或所有附图是范例的示意图，因此，它们不需要描述所示元件的实际相对大 小或位置。为清楚理解示出一个或多个实施例的目的而提供附图，它们不用于限制后附权 利要求的范围或含义。
[003引详细描述
[0034] 本申请中，文本设及出现的组成，组合物和方法的各种实施例。描述的各种实施例 意味着提供各种示例性的实施例，不应该被解释为替代品的描述。相反，应注意本文所提供 的各种实施例的描述可能是重叠的范围。本文所讨论的实施例仅仅是说明性的，并不意味 着限制本发明的范围。
[0035] 此外本申请中，各种出版物，专利和公布的专利说明书通过引用作为参考。因此该 些出版物，专利和公布的专利说明书的披露内容通过引用合并到本申请中W更充分地描述 本发明所属领域的状况。
[0036] 如说明书和权利要求书中所用，除非上下文清楚地另有规定，单数形式"一"、"一 个"和"该"包括复数形式。例如，术语"一电极"包括多种电极，包括它们的混合物。
[0037] 如本文所用，术语"包括"旨在表示装置和方法包括所列举的组件或步骤，但不排 除其他的。当用于限定装置和方法时，"基本上由……组成"将意味着从该组合中排除任何 实际意义的其他零件或步骤。"由……组成"将意味着排除其他零件或步骤。该些转换术语 各自限定的实施例落在本发明的范围内。
[003引全部数字称号，例如，距离、尺寸、温度、时间、电压和浓度，包括范围，是近似值，可 改变（+)或（-)0. 1的增量。虽然并不总是明确地指出，但应当理解，术语"约"在所有数值 之前。虽然并不总是明确说明，但还应当理解，本文描述的零件仅仅是示例性的，它们的等 价物是现有技术中已知的。
[00測双孔装置
[0040] 本申请的一个实施例提供两孔装置。该装置包括=个室和使诸室之间流体连通的 两个孔。此外，各室包括用于连接电源的电极，W便在诸室之间的各孔上产生不同的电压。
[0041] 依照本申请的一个实施例，提供一种装置，包括上室、中间室和下室，其中所述上 室通过第一孔与所述中间室连通，并且所述中间室通过第二孔与所述下室连通，其中所述 第一孔和第二孔的直径约1纳米至约100纳米，彼此间隔约10纳米至约1000纳米，且其中 各室包括用于连接电源的电极。
[0042] 参考图1 (I)，装置包括上室（室A)，中间室（室B)和下室（室C)。通过各具有独 立孔（111和112)的两独立层或膜（101和102)分隔室。此外，各室包含用于连接电源的 电极（121，122和12：3)。很明显，上、中间和下室的注释是相对而言的，并不表示，例如，上室 相