rug resistance gene)进行了连结的 核酸断片，则可容易地对发生同源重组的株进行选拔。另外，也可采用如下方式，即：在基因 组上藉由上述方法通过同源重组插入将耐药性遗传基因与在特定条件下可致死的遗传基 因进行了连结的遗传基因，然后，对耐药性遗传基因和在特定的条件下可致死的遗传基因 进行置换，以将目的遗传基因藉由同源重组进行导入。
[0101] 再有，就导入目的遗传基因的重组微生物的选择方法而言，对其并无特别限制，但 是优选为，可容易地仅对导入目的遗传基因的重组微生物进行选择的方法。
[0102] (用于制造1，4- 丁二醇的微生物的使用方法、培养条件、及所获得的1，4- 丁二醇 的获得方法）
[0103] 图1中示出了本实施方式的1，4_ 丁二醇的制造方法的酵素系的一例。在本实施 方式中，1，4- 丁二醇可通过使用藉由形质转换等在微生物体内发现上述一系列遗传基因的 培养物而获得。这里需要说明的是，遗传基因可通过个别地或作为一系列的簇（cluster) 而插入任意的带菌媒介（vector)，以对宿主微生物进行形质转换。另外，通过将所获得的形 质转换体在适当的碳源（carbon source)、例如以葡萄糖为碳源的培养基中进行培养，可发 现各遗传基因。如果是可在宿主中构成并发现的遗传基因，则可通过在培养基中对形质转 换体进行培养来发现遗传基因。另一方面，如果各遗传基因是在带菌媒介（vector)上所配 置的调控子（regulator)的控制下而构成的，则可通过添加诱导基质，以移行至诱导环境 的方式来发现各编码遗传基因。这里需要说明的是，本实施方式中的培养是指包括所有的 通常的微生物培养的培养条件的意思，另外，培养步骤是指对微生物在用于制造1，4-丁二 醇的充分的时间和条件下进行培养的意思。
[0104] 本发明的发明人发现，在对可选择（S) -3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素进 行编码的遗传基因、及、对可选择（S)-3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基 因中，藉由使用对特定种类的酵素进行编码的遗传基因，可使1，4-丁二醇的生产性显着提 尚。
[0105] 具体而言，在发现对可选择（S) -3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素（3-羟丁 酰CoA脱氢酶（EC编号：1. 1. 1. 35)或3-羟酰CoA脱氢酶（EC编号：1. 1. 1. 157))进行编码 的遗传基因的情况下，使用还发现了对烯酰CoA水合酶（EC编号：4. 2. 1. 17)进行编码的遗 传基因的微生物或其培养物。
[0106] 另外，在发现对可选择（R)-3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素（EC编号： 1. 1. 1.36)进行编码的遗传基因的情况下，使用还发现了对烯酰CoA水合酶（EC编号： 4. 2. 1. 119)或3-羟丁酰CoA脱水酶（EC编号：4. 2. 1. 55)进行编码的遗传基因的微生物或 其培养物。
[0107] 另外，在本实施方式的1，4_ 丁二醇的制造方法中，优选为，在藉由形质转换等 发现了上述遗传基因的微生物中，还使用还发现了对乙烯乙酰CoAA异构酶（EC编号： 5. 3. 3. 3)进行编码的遗传基因、和/或、对4-羟丁酰CoA脱水酶（EC编号：4. 2. 1. 120)进 行编码的遗传基因、和/或、对酰基CoA还原酵素（EC编号：1. 2. 1. 10)进行编码的遗传基 因的微生物或其培养物。在对这些遗传基因的全部或一部分进行组合的情况下，由于更可 提高1，4- 丁二醇的生产性，所以为较佳。
[0108] 这样，本实施方式的1，4_ 丁二醇的制造方法由于使用了对特定酵素进行编码的 遗传基因，所以能以较高的生产性来制造1，4- 丁二醇。
[0109] 这里需要说明的是，在本实施方式中，对作为乙酰乙酰CoA还原酵素的基质的、用 于提供3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA的供给方法而言，对其并无特别限制。例如可列举出： 藉由后述宿主所具有的醣酵解（glycolysis)，利用以进行培养时所用的任意的炭素源、例 如葡萄糖等糖质为来源所供给的乙酰（acetyl) CoA的方法等。此时，在乙酰CoA的供给下， 从2分子的乙酰CoA使1分子的CoA脱离，使用对用于提供乙酰乙酰CoA的、0 -酮硫解酶 (ketothiolase) (EC编号：2.3. 1.9)进行编码的遗传基因或其同源染色体，可进行乙酰乙 酰CoA的供给。
[0110] 另外，以乙酰CoA和丙二酰（malonyl)CoA为基质（也可为中间体、前驱体），并 使用对不可逆地生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA合成酵素（EC编号： 2.3. 1. 194)进行编码的遗传基因或其同源染色体，也可进行乙酰乙酰CoA的供给。有 关乙醜乙醜CoA合成酵素，具体可参考例如"Unprecedented acetoacetyl-coenzyme A synthesizing enzyme of the thiolase superfamily involved in the mevalonate pathway.，Proc. Natl. Acad. Sci.，U.S. A. 107,11265-11270 (2010). " 等非专利文献等。
[0111] 本实施方式中的同源染色体包括直系同源（ortholog)和旁系同源（paralog)。直 系同源是指从基于具有共同祖先的遗传基因藉由物种分化所生成的物种间所对应的遗传 基因及其藉由该遗传基因所获得的酵素组。旁系同源是指从相同物种内不是藉由物种分化 而是藉由遗传基因重复所生成的物种间所对应的遗传基因及其藉由该遗传基因所获得的 酵素。同源染色体是指与直系同源和旁系同源无关地从序列中具有同一性的遗传基因及其 藉由该遗传基因所获得的酵素。
[0112] 具体而言，上述遗传基因的同源染色体（遗传基因）是指具备与该遗传基因具有 90%以上的同一性、优选为、具有95%以上的同一性的碱基序列的遗传基因，较好的是指与 该遗传基因完全相同或其盐基的1个或数个发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的 遗传基因。
[0113] 另外，同源染色体遗传基因还包括在渐快条件下使对象遗传基因和具有互补 碱基序列的遗传基因进行杂交的遗传基因。具体而言，使用对公共数据库进行检索的 同族关系（homology)检索程序（例如，BLAST、FASTA等）、或者、根据使用了由同定 (identification)遗传基因的至少一部分所组成的探针（prob)(由该遗传基因的碱基序 列组成的DNA和由互补碱基序列组成的DNA)的渐快条件下的杂交或聚合酶（polymerase) 连锁反应（PCR)等常用的方法，可获得遗传基因或藉由该其遗传基因的形质转换所得到的 酵素。另外，所属技术领域的技术人员还可以通过对碱基序列进行置换等自己来进行设 计。这里需要说明的是，作为这里所说的渐快条件，例如可列举出"Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION(Joseph Sambrook, David ff. Russell. , Cold Spring Harbor Laboratory Press)"之非专利文献中所记载的杂交条件。具体而言，杂交条件是 指在包括6XSSC(1XSSC的组成：0. 15M的氯化钠，0. 015M的柠檬酸钠；pH :7. 0)、0. 5%的 SDS、5X邓哈特（Denhardt' s)溶液、及100mg/mL的緋鱼（herring)精子DNA的溶液中与 探针一起进行65°C下8~16个小时的恒温保持的杂交条件。
[0114][培养方法]
[0115] 就本发明的反应而言，最简便的可通过如下方式来实现，即：例如，对形质转换体 采用LB培养基等荣养培养基，在15°C~40°C、最好为18°C~37°C的温度下，进行24个小时 左右的培养，之后，移殖至以通常的碳源、例如以〇. 01~50%最好为0. 1~30%的葡萄糖 为碳源的培养基，继续在同样的温度下，进行1~200个下时左右的培养，在该过程中，培养 液中会蓄积1，4-丁二醇。另外，也可以根据菌的增殖?反应的进行所导致的碳源的消耗， 连续或者间歇地进行碳源的添加，此时的反应液中的碳源浓度并不限于上述数值。
[0116] 作为用于对微生物进行培养的培养基碳源，可单独或组合使用葡萄糖、蔗糖、果糖 等的糖类、甘油（glycerol)等的多元醇（polyol)、乙醇（ethanol)、醋酸、梓檬酸、琥J白酸、 乳酸、安息香酸、脂肪酸等的有机物或者它们的碱性金属盐、n-石蜡等的脂肪族碳化氢类、 芳香族碳化氢类、及例如蛋白胨、肉精汁（extract)、鱼精汁、大豆粉、麸等的天然有机物，其 浓度通常为0.01%~30%，最好为0. 1%~20%左右。
[0117] 作为用于对微生物进行培养的培养基氮源，可单独或组合使用例如硫酸铵、磷酸 铵、硝酸钠、硝酸钾等的无机氮化合物、尿素、尿酸等的含氮有机物、及蛋白胨、肉精汁、鱼精 汁、大豆粉等的天然有机物，其浓度通常为0.01 %~20%，最好为0. 1 %~10%左右。
[0118] 再有，为了对菌的生育和酵素活性进行改善，根据需要，还可以添加磷酸2氢钾等 的磷酸盐、硫酸镁、硫酸亚铁、醋酸钙、氯化锰、硫酸铜、硫酸亚铅、硫酸钴、硫酸镍等的金属 盐。添加浓度因培养条件而异，一般来说，就磷酸盐而言，其为0. 01%~5%，就镁盐而言， 其为lOppm~1%，而就其他化合物而言，其为0? lppm~l，000ppm左右。另外，为了对菌的 生育和酵素活性进行改善，还可以根据所选择的培养基，做为维生素类、氨基酸、核酸等的 供给源来添加lppm~lOOppm左右的例如酵母精汁、酪蛋白氨基酸（casamino acid)、及酵 母核酸。
[0119] 培养基的pH优选为调整至4. 5~9,最好为调整至5~8