。另外，如果采用远心分 离和膜过滤等方法从培养液中分取（分离并提取）藉由上述培养基而预先培养的微生物菌 体，并在包括反应原料的水、生理食盐水、或者pH被调整为与培养基的pH相同的磷酸、醋 酸、硼酸，三（羟基甲基）氨基甲烷等及它们的盐所组成的缓冲液等中进行再次悬浊和反 应，则可有效地减少反应液中的夹杂物，并可容易地进行之后的生成物的分取。就反应中的 pH而言，在使用具有足够浓度的缓冲液的情况下一般都可被维持，但是，在随着反应的进行 上述pH发生了逸脱的情况下，最好使用氢氧化钠和氨等进行适当的调整，以保持具有同样 的pH。
[0120] 在1，4-丁二醇在反应液中进行蓄积从而导致反应速度降低了的情况下，优选采 用根据生成物的浓度向反应液中连续追加水、生理食盐水、反应缓冲液等以进行稀释的方 法。另外，通过在反应速度降低了的时点对菌进行分取，并将上清（supernatant)作为生产 物溶液进行回收，之后再把分取的菌再次放回包含反应原料的溶液或者悬浊液中，也可使 反应速度恢复。另外，该操作可以通过远心分离器或分离膜等连续或分批地进行。
[0121] 就反应液中所生成的1，4-丁二醇的分离、回收及精制而言，其可在1，4-丁二醇的 生成量到达了实质的量的时点，并在藉由远心分离从反应液中除去了菌体之后或在原反应 液中采用一般的有机化合物的分离、回收及精制的手段来进行。例如，针对从培养液中除去 了菌体等的过滤液，可采用适当的有机溶媒等进行提取。最后，通过对该提取物本身进行蒸 馏（distillation)、再采用适当的溶媒进行再提取、或者、使用硅胶等的层析进行精制或对 其进行多段蒸馏等，就可获得高纯度的1，4-丁二醇。
[0122] (实施例及比较例）
[0123] 接下来，通过对实施例进行说明，以对本发明进行更详细的说明。
[0124] 表1中示出了想定的反应步骤、对各反应步骤进行催化的酵素、及对该酵素进行 编码而使用的遗传基因。这里需要说明的是，遗传基因的序列编号与序列表中的序列编号 相对应。
[0125] [表 1]
[0126]
【主权项】
1. 一种1，4- 丁二醇的制造方法，其使用微生物和/或其培养物，并通过使用了乙酰乙 酰CoA还原酵素和烯酰CoA水合酶的酵素反应系，依次经由乙酰乙酰CoA、3-羟丁酰CoA、及 巴豆酰CoA来制造1，4- 丁二醇，所述1，4- 丁二醇的制造方法的特征在于， 所述乙酰乙酰CoA还原酵素和所述烯酰CoA水合酶分别相对于3-羟丁酰CoA的立体 异构体具有特异性。
2. 如权利要求1记载的1，4- 丁二醇的制造方法，其中， 所述乙酰乙酰CoA还原酵素是可选择（S)-3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素， 所述烯酰CoA还原酵素是可选择（S) -3-羟丁酰CoA的的烯酰CoA水合酶， 所述微生物包括： (1) 对所述可选择（S)-3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因； 及 (2) 对所述可选择（S) -3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因。
3. 如权利要求2记载的1，4- 丁二醇的制造方法，其中， 所述可选择（S) -3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素是3-羟丁酰CoA脱氢酶（EC编号：1.I.L35)或3-羟基CoA脱氢酶（EC编号：1.I.L157)， 所述可选择（S)-3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶是烯酰CoA水合酶（EC编号： 4. 2. 1. 17) 〇
4. 如权利要求2记载的1，4- 丁二醇的制造方法，其中， 对所述可选择（S)-3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下 述（a)~（c)的任一个所述的遗传基因， 对所述可选择（S)-3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因是下述（d)~ (f)的任一个所述的遗传基因，即： (a) 具有序列编号2的盐基序列的遗传基因； (b) 具有盐基序列的遗传基因，该盐基序列是序列编号2的盐基序列中1个或多个盐基 发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列，并且，该盐基序列相对于序列编号 2的盐基序列具有90%以上的同一性； (c) 在渐快条件下，对具有序列编号2的碱基序列的遗传基因和具有互补碱基序列的 遗传基因进行杂交的遗传基因； (d) 具有序列编号4的盐基序列的遗传基因； (e) 具有盐基序列的遗传基因，该盐基序列是序列编号4的盐基序列中1个或多个盐基 发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列，并且，该盐基序列相对于序列编号 4的盐基序列具有90%以上的同一性；及 (f) 在渐快条件下对具有序列编号4的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗 传基因进行杂交的遗传基因。
5. 如权利要求1记载的1，4- 丁二醇的制造方法，其中， 所述乙酰乙酰CoA还原酵素是可选择（R) -3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素， 所述烯酰CoA还原酵素是可选择（R) -3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶， 所述微生物包括： (1)对所述可选择（R)-3_羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因； 及 (2)对所述可选择（R) -3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因。
6. 如权利要求5记载的1，4- 丁二醇的制造方法，其中， 所述可选择（R)-3_羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素是乙酰乙酰CoA还原酵素（EC编号：1.I. 1. 36)， 所述可选择（R)-3_羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶是烯酰CoA水合酶（EC编号： 4. 2.L55 或EC编号：4. 2.L119)。
7. 如权利要求5记载的1，4- 丁二醇的制造方法，其中， 对所述可选择（R)-3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下 述（a)~（c)的任一个所述的遗传基因， 对所述可选择（R)-3_羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因是下述（d)~ (f)的任一个所述的遗传基因，即： (a) 具有序列编号3的盐基序列的遗传基因； (b) 具有盐基序列的遗传基因，该盐基序列是序列编号3的盐基序列中1个或多个盐 基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列，并且，该盐基序列相对序列编号 3的盐基序列具有90%以上的同一性； (c) 在渐快条件下对具有序列编号3的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗 传基因进行杂交的遗传基因； (d) 具有序列编号5的盐基序列的遗传基因； (e) 具有盐基序列的遗传基因，该盐基序列是序列编号5的盐基序列中1或多个盐基 发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列，并且，该盐基序列相对于序列编号 5的盐基序列具有90%以上的同一性；及 (f) 在渐快条件下对具有序列编号5的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗 传基因进行杂交的遗传基因。
8. 如权利要求1记载的1，4- 丁二醇的制造方法，其中，所述微生物还包括： (1) 对乙烯乙酰CoAA异构酶（EC编号：5. 3. 3. 3)进行编码的遗传基因； (2) 对4-羟丁酰CoA脱水酶（EC编号：4. 2. 1. 120)进行编码的遗传基因；及/或 (3) 对酰基CoA还原酵素（EC编号：1. 2. 1. 10)进行编码的遗传基因。
9. 如权利要求1记载的1，4- 丁二醇的制造方法，其中， 所述微生物是大肠杆菌、酵母、棒状细菌、或梭菌属细菌。
10. -种微生物，用于通过使用了乙酰乙酰CoA还原酵素和烯酰CoA水合酶的酵素反应 系，依次经由乙酰乙酰C〇A、3-羟丁酰CoA、及巴豆酰CoA来制造1，4-丁二醇，所述微生物的 特征在于， 所述乙酰乙酰CoA还原酵素和所述烯酰CoA水合酶分别相对于3-羟丁酰CoA的立体 异构体具有特异性。
11. 如权利要求10记载的微生物，其中， 所述乙酰乙酰CoA还原酵素是可选择（S)-3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素， 所述烯酰CoA还原酵素是可选择（S) -3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶， 所述微生物包括： (1) 对所述可选择（S)-3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因； 及 (2) 对所述可选择（S) -3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因。
12. 如权利要求10记载的微生物，其中， 所述乙酰乙酰CoA还原酵素是可选择（R) -3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素， 所述烯酰CoA还原酵素是可选择（R) -3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶， 所述微生物包括： (1) 对所述可选择（R)-3_羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因； 及 (2) 对所述可选择（R) -3-羟丁酰CoA的烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因。
13. 如权利要求10记载的微生物，其中， 所述微生物是大肠杆菌、酵母、棒状细菌、或梭菌属细菌。
【专利摘要】一种1,4-丁二醇的制造方法，其使用微生物和/或其培养物，并通过使用了乙酰乙酰CoA还原酵素和烯酰CoA水合酶的酵素反应系，依次经由乙酰乙酰CoA、3-羟丁酰CoA、及巴豆酰CoA来制造1,4-丁二醇，其中，所述乙酰乙酰CoA还原酵素和所述烯酰CoA水合酶分别相对于3-羟丁酰CoA的立体异构体具有特异性。
【IPC分类】C12N15-09, C12N1-21, C12N1-19, C12P7-18
【公开号】CN104781409
【申请号】CN201380059308
【发明人】青木裕史, 小木户谦, 桥本阳子, 米田正
【申请人】昭和电工株式会社
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年9月13日
【公告号】EP2924122A1, US20150275236, WO2014080683A1