皿，6cm的培养皿，1cm培养皿，15cm培养皿等都可以使用。作为培养容器，需要是能够细胞贴壁的细胞培养用经过涂层处理的，或经过胶原蛋白，层粘连蛋白等涂层处理的容器都可以使用。
[0041]将含有黑色素细胞以及表皮细胞的细胞分散液接种于上述培养容器中进行培养。作为合适的培养液，Ca2+浓度要控制在0.1mM内，低葡萄糖(1000mg/L)的无血清培养液也可以使用，类似的培养液有:M254 (商品名)；GIBC0公司。
[0042]类似这样的无血清培养液中也可以添加胰岛素，EGF，FGF，KGF，SCF7Bfgf,内皮素，aMSH等的荷尔蒙，成长因子。另外，一些在细胞培养时常用的培养液也可以使用，比如，除了以上的无血清培养液外，还有 MCDB153，Mediuml99, DMEM(Dulbecco，s MEM), RPMI1640,F-10, F-12, MMEM,限制的角化细胞培养基 SFM(Defined keratinocyte SFM) ；GIBC0,10744-019，角化细胞培养基 SFM(Keratinocyte SFM) ;GIBC0，17005-4=042 等。作为添加物，除了以上这些外，还有氢化可的松，转铁蛋白，孕留酮，乙醇胺，血清素，肾上腺素等都是可以用的。
[0043]类似于这类的无血清培养液中也可以加入用于抑制成纤维细胞增殖的药剂，类如霍乱毒素，异丙肾上腺素，IBMX等。
[0044]为了能够适用于广泛的移植领域，从皮肤片取得的黑色素细胞，皮肤细胞通过传代，可以培养出更多的细胞。因为只是通过共培养形成的皮肤片状培养物中黑色素细胞会集中分布，表皮细胞的分布也会集中，所以传代可以解决这样的问题。但是由于过多的传代黑色素细胞和表皮细胞比例就会降低，所以最好传代控制在3代以内。关于细胞传代，使用普通的胰蛋白酶处理，accutase细胞消化液处理等方法就可以。
[0045]培养容器中的表皮细胞达到整体化后，将培养液换成分化培养用的培养液。然后就能培养出拥有复数细胞层的片状的近似皮肤的培养组合物。作为分化培养液，可以使用上述无血清培养液中添加了 Ca2+浓度控制在0.2?2.2mM之间的氯化钙的培养液，也可以使用KGM培养液。在分化培养液中常规培养为3?14天，理想的时间为5?12天后，细胞会形成多层的皮状培养组合物。作为用于分化诱导用的无血清培养液的Ca2+浓度，一半在0.5?1.9mM之间，理想范围为0.8?1.6mM,如果能够达到1.0?1.4mM那就更好了。
[0046]作为分化用培养液，可以使用上述的无血清培养液，培养液中添加的葡萄糖的浓度在3000?5000mg/L，最理想的范围是4000?4500mg/L。
[0047]培养组合物根据以上方法，一般需要培养10?50天，最理想的天数是在12?35天。
[0048]这样的一个培养组合物，通过目测就能了解黑色的程度，具体细节上，就需要通过光学显微镜来观察了解，其中基础的黑色素细胞和角质细胞的数量比，表皮角质细胞100:黑色素细胞数量在I?50之间为基础，I?30为普通，2?20之间为理想，3?10之间为完美。数量比可以通过光学显微镜来观察测定，另外当培养组织物在消化酶处理的阶段，成型或半成型的时候也能计数测定。
[0049]本发明的培养组合物没有规定动物的种类，但是治疗白癜风时最好使用人由来物质。特别对于黑色素细胞和表皮角质细胞最好是同一个人由来比较好，因为同一个人提供自体的组织形成的培养组成物没有排异性。另外，因为是没有使用异类动物或同类的滋养层细胞做成的培养组合物，所以在移植的时候相应的风险就比较小。
[0050]本发明的细胞培养组合物中的黑色素细胞有多个的树状凸起，类似于人类身体环境。该形态能通过DOPA染色等对黑色素细胞细胞培养组合物进行染色，然后用光学显微镜观察。据数据显示，该形态的黑色素细胞的黑色素生产能力相当高。
[0051 ] 黑色素细胞细胞培养组合物这项研究虽然适用于局限性白癜风的治疗，但也适用于烧伤，过度晒伤，痔，刺青等的各类色素异常的治疗。另外，不仅在医疗方面，在对黑色素进行药效评价的时候也适用美白效果等。比如:上述细胞培养组合物在培养的时候，在培养液中添加各种药物，从而对黑色素细胞的形成进行评价，从而达到筛选有抑制黑色素生长作用的药物等。
[0052]附图简述
[0053]图1是成型的培养组合物的苏木精染色图片。其中图1A为未传代培养组合物，图1B为传代培养组成物。
[0054]图2是培养组合物的DOPA染色图像，咖啡色点(深色点)为黑色素细胞，青紫色的点位(较浅色的点)是表皮细胞的核。图2A是未传代培养组合物，图2B为传代培养组合物。其中，采用的显微镜是OLYMPUS公司制造1X51，DP26显微摄影系统，焦距:x4倍。
[0055]图3是培养组合物的移植图片。图3A为移植前，图3B是移植4个月后。
具体实施方案
[0056]以下是对于此项发明的表皮组织培养物以及用途和制造方法的实例展示以及具体说明，但是本发明并不局限于此。
[0057](I)从皮肤组织提取黑色素细胞以及表皮细胞的过程
[0058]对患者的腰部使用碘液脱脂棉进行杀菌，定位后采集组织片。采集的组织片在碘液中浸泡后，再用70%酒精浸泡灭菌，然后用PBS清洗。将组织片切碎，放入消化液中(消化液:TrypLE被PBS5倍稀释后)4°C环境下放置16?24个小时。使用细胞过滤设备(cellstrainer)回收残渣。得到的残渣使用胶原蛋白酶(GIBC0公司)在37°C环境下处理3?4小时，离心后进行细胞回收。
[0059](2)含黑色素细胞的培养组合物的制作
[0060]回收的细胞接种于培养容器内，使用无血清培养液(M254 ；GIBC0)放在37°C 5%的二氧化碳培养箱中进行培养。培养7?10天，成型60?70%。
[0061](3)成纤维细胞的排除过程
[0062]在培养含有黑色素细胞培养组合物的时候，当发现成纤维细胞混入过多的时候，使用含有0.01?0.02%EDTA的PBS在37 °C环境下进行5?10分钟的处理后，使用吸量管将成纤维细胞清除。
[0063](4)黑色素细胞均匀分布的培养组合物的制作
[0064]将含有黑色素细胞的培养组合物中的成纤维细胞清除后，使用含有0.05%胰蛋白酶的PBS，在37°C环境下培养3?5分钟，从容器中剥离后进行回收，回收的细胞进行接种，用无血清培养液培养5?10天，达到成型状态后，更换KGM培养液，继续培养7?10天，得到培养组合物(图1)。此外为了能够有对比参照物，也制作了没有传代的培养组合物。
[0065](5)黑色素细胞的色素生产能力的评价过程
[0066]( 5-1)培养组合物的外观评价
[0067]完成的培养组合物，通过目测对其外观的黑色度进行评价。另外使用光学显微镜测定黑色素细胞和表皮角质细胞的数量比。
[0068](5-2) DOPA 染色等
[0069]将黑色素培养组合物进行DOPA染色。使用光学显微镜，观察被DOPA染色的黑色素细胞的形状，黑色素细胞和表皮角质细胞的数量以及堆积的细胞数(图2)。
[0070]由这些实验结果可知，本发明的皮肤制剂能够很好的促进黑色素细胞的色素产生能力。
[0071](6)向人体移植
[0072]对患者的白斑部位使用碘液脱脂棉进行灭菌后，打磨表皮。将培养组合物覆盖在打磨部位并摊开。覆盖上消毒的纱布，然后用纱布裹住。3-5月后，观测移植区域，和非白斑部进行对比，确认没有色素脱色现象，状态良好(图3)。因此，本发明的培养组合物能够很好的用于稳定性白癜风的治疗，并且能够达到大面积的色素均匀再生。
[0073]虽然本发明已经以较佳实施例揭示如上，但是其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围应当视所附的权利要求所界定的为准。
【主权项】
1.一种皮肤制剂，其包含黑色素细胞和表皮细胞的共培养组合物，所述共培养组合物中黑色素细胞具有增强的色素产生能力并且所述共培养组合物通过培养形成有I?5层细胞层的以二维方式连接的展开培养物。
2.如权利要求1所述的皮肤制剂，其特征在于，所述皮肤制剂中表皮细胞的数量与黑色素细胞的数量之比为100:1-50。
3.如权利要求1所述的皮肤制剂，其特征在于，所述皮肤制剂中表皮细胞的数量与黑色素细胞的数量之比为100:3-10。
4.一种促进黑色素细胞色素产生的培养液，其特征在于，所述培养液包含如权利要求1所述的皮肤制剂。
5.一种促进黑色素细胞色素产生的培养液，其特征在于，所述培养液包含如权利要求1所述的皮肤制剂的提取物。
6.如权利要求1所述的皮肤制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤: a.从皮肤组织中提取黑色素细胞和表皮细胞； b.将步骤a)获得的黑色素细胞和表皮细胞共培养； c.任选地去除成纤维细胞； d.通过传代培养，使黑色素细胞均匀分布； e.评价黑色素细胞的色素生产能力，选定接近皮肤颜色的皮肤制剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤d)的传代控制在3代以内。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤c)去除成纤维细胞的过程包括加入抑制成纤维细胞增殖的试剂，选自EDTA、霍乱毒素、异丙肾上腺素、IBMX。
9.如权利要求1所述的皮肤制剂在进行皮肤美容产品筛选中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述皮肤美容产品包括:美白产品、白癜风治疗产品、过度晒伤治疗产品、烧伤治疗产品、大面积黑痣治疗产品、疤痕治疗产品、痤疮治疗产品和纹身治疗产品。
【专利摘要】本发明涉及一种皮肤制剂，其包含黑色素细胞和表皮细胞的共培养组合物，所述共培养组合物中黑色素细胞具有增强的色素产生能力并且所述共培养组合物通过培养形成有1～5层细胞层的以二维方式连接的展开培养物。本发明还涉及包含该皮肤制剂或皮肤制剂的提取物的培养液以及该皮肤制剂的制备方法及其应用。
【IPC分类】C12N5-071, C12Q1-02
【公开号】CN104877953
【申请号】CN201410073140
【发明人】徐金华, 宇山太郎, 吴复跃, 何振东
【申请人】上海尚瑞生物医药科技有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2014年2月28日