一种连续制备桑黄菌丝体多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]^HPhellinus Iinteus)属担子菌亚门多孔菌科、木层孔菌属是一种珍稀的药用真菌，有“森林黄金”之美称，广泛应用于东亚地区，尤其是韩国、中国和日本。桑黄多糖是主要生物活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗血管生成和抗氧化等多种生理活性和药用价值。由于受自身生物特性和外界环境的影响，野生桑黄菌子实体稀少，人工栽培周期长，无法满足人们对珍稀桑黄资源的广泛需求，对桑黄菌人工发酵培养获取桑黄菌丝体为其产业化开发提供了可能，且发酵周期短，不受季节和环境的限制，发酵所得菌丝体多糖与子实体多糖功效相当。然而，目前国内外关于桑黄菌丝体多糖研宄还主要以水提物或水提多糖为主，水提后残留物一般丢弃，造成生物质能源的极大浪费，限制了桑黄活性多糖的深度开发及利用。
[0003]经检索，目前关于水提后残留物中桑黄菌丝体多糖的制备还未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的问题是提供一种连续制备桑黄菌丝体多糖的方法。
[0005]本方法的具体步骤是从液体发酵培养的桑黄菌丝体中通过热水、酸液和碱液连续提取有生物活性的粗多糖、除蛋白、透析和冷冻干燥。本发明的一种连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，其特征在于按照下述步骤进行:
一、脱脂:将桑黄菌丝体粉碎，用有机溶剂以常规方式脱脂；
一、水提多糖的制备；
O水提醇沉:步骤一所得的脱脂后的桑黄菌丝体按1:10 g/mL的料液比加入蒸馏水，充分搅拌均匀后，95°C回流提取8 h。混合物离心，上清液合并于45°C旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原体积的1.5倍，加入4倍体积的95%乙醇，4°C冰箱静置过夜，离心收集沉淀，得水提桑黄菌丝体粗多糖。重复提取I次。
[0006]2)除蛋白:步骤I)所得的水提桑黄菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，用氯仿和正丁醇按体积比5:1混合的试剂去除其蛋白。
[0007]3)透析:步骤2)所得的除蛋白的多糖水溶液浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，透析袋透析，收集桑黄菌丝体多糖的提取液。
[0008]4)冷冻干燥:步骤3)所得的桑黄菌丝体提取液冷冻干燥，得淡黄色絮状的水提桑黄菌丝体多糖，记为PLW，苯酚-硫酸法测得中性糖含量为64.5%，考马斯亮蓝染色法测得蛋白质含量为1.5%，硫酸-咔唑法测得糖醛酸含量为11.1%。
[0009]三、酸提多糖的制备:步骤二中水提后的残留物加入质量浓度为1%草酸铵溶液，充分搅拌均匀后，于95°C回流提取8 ho离心，浓缩，乙醇沉淀，离心收集沉淀，得酸提桑黄菌丝体粗多糖。重复提取I次。除蛋白、透析和冷冻干燥按步骤二中方法进行，得淡黄色絮状的酸提桑黄菌丝体多糖，记为PLA，苯酚-硫酸法测得中性糖含量为78.0%，考马斯亮蓝染色法测得蛋白质含量为0.2%，硫酸-咔唑法测得糖醛酸含量为14.6%。
[0010]四、碱提多糖的制备:步骤三中酸提后的残留物加入摩尔浓度为1.25 mol/L氢氧化钠和质量浓度为0.05%硼氢化钠，室温下提取3 ho离心，浓缩，加乙酸溶液终质量浓度为36%，乙醇沉淀，离心收集沉淀，得碱提桑黄菌丝体粗多糖。重复提取I次。除蛋白、透析和冷冻干燥按步骤二中方法进行，得淡黄色絮状的碱提桑黄菌丝体多糖，记为PLN，苯酚-硫酸法测得中性糖含量为84.9%，不含蛋白质，硫酸-咔唑法测得糖醛酸含量为16.9%。
[0011]五、体外抗氧化能力的评价:通过体外抗氧化模型，综合评价连续制备的三种桑黄多糖PLW、PLA和PLN的清除羟自由基(.0Η)能力、清除1，1- 二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力、等价抗氧化能力(TEAC)、三价铁离子还原能力(FRAP)和保护过氧化氢诱导损伤的人类神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞作用。当样品质量浓度为2.0 mg/mL时，三种多糖的.0H清除率分别为72.5%,76.2%和83.3%, DPPH清除率分别为58.6%,65.5%和72.1% ;三种多糖的TEAC值分别为140.5、191.2和206.7 μ mo I Trolox/g样品，FRAP值分别为46.3、51.6和54.4 μ mo I Fe2+/g样品；当样品质量浓度为80 μ g/mL时，三种多糖预处理后的细胞存活率分别为84.7%,87.4%和88.7%。三种多糖均具有良好的清除自由基能力和体外抗氧化活性。
[0012]本发明建立桑黄菌丝体多糖的连续制备工艺，此方法获得的桑黄菌丝体多糖具有明显的清除自由基能力和抗氧化活性。最大限度的增加原料的利用率，降低成本。同时，该方法同样适用于其他液体发酵培养得到的真菌菌丝体如灵芝、冬虫夏草、灰树花等活性多糖的制备。
[0013]本发明桑黄菌丝体多糖的连续提取制备方法简单、易行、能规模化生产。
【具体实施方式】
[0014]以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不局限于此实施例。
[0015]实施例1
1、脱脂:将桑黄菌丝体粉碎，脱脂棉布包裹，置于500 mL索氏抽提器中，加入200~300mL石油醚(沸程:30~60°C)，35°C回流6 h，重复脱脂I次，自然晾干。
[0016]2、水提多糖的制备。
[0017]I)水提醇沉:将步骤I所得的脱脂后的桑黄菌丝体100 g按1:10 g/mL的料液比加入蒸饱水1000 mL，置于2000 mL圆底烧瓶中，充分搅拌均勾后，于95°C回流提取8 h。混合物用300 mL塑料离心管，5000 rpm，10 min离心，上清液合并于45°C旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原体积的1.5倍，加入4倍体积的95%乙醇，4°C冰箱静置过夜，离心收集沉淀，得水提桑黄菌丝体粗多糖。重复提取I次。
[0018]2)除蛋白:步骤I)所得的水提桑黄菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，氯仿和正丁醇按照5:1体积比混合制备脱蛋白试剂，将脱蛋白试剂按多糖水溶液1:5体积加入，混合物于水浴振荡锅中，室温下振摇搅拌I h，5000 rpm、10 min离心，除去蛋白。如此重复除蛋白8~10次。
[0019]3)透析:步骤2)所得的除蛋白的多糖水溶液浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用分子截留量8000~12000 Da透析袋将上清液在流水中透析48 h，再在蒸馏水中透析48 h，除去寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集桑黄菌丝体多糖的提取液。
[0020]4 )冷冻干燥:步骤3 )所得的桑黄菌丝体提取液倒入玻璃培养皿中，-80 0C预冻，冷冻干燥，得淡黄色絮状的水提桑黄菌丝体多糖，苯酚-硫酸法测得中性糖含量为64.5%，考马斯亮蓝染色法测得蛋白质含量为1.5%，硫酸-咔唑法测得糖醛酸含量为11.1%。
[0021]3、酸提多糖的制备:步骤2中水提后的残留物加入1000 mL，质量浓度为1%草酸铵溶液，置于2000 mL圆底烧瓶中，充分搅拌均匀后，于95°C回流提取8 h。离心，浓缩，乙醇沉淀，离心，得酸提桑黄菌丝体粗多糖。重复提取I次。除蛋白、透析和冷冻干燥按步骤2中方法进行，得淡黄色絮状的酸提桑黄菌丝体多糖，苯酚-硫酸法测得中性糖含量为78.0%，考马斯亮蓝染色法测得蛋白质含量为0.2%，硫酸-咔唑法测得糖醛酸含量为14.6%。
[0022]4、碱提多糖的制备:步骤3中酸提后的残留物加入1000 mL摩尔浓度为1.25mol/L氢氧化钠和质量浓度为0.05%硼氢化钠，充分搅拌均匀后，室温下提取3 h。离心，浓缩，加乙酸溶液终质量浓度为36%，乙醇沉淀，离心收集沉淀，得碱提桑黄菌丝体粗多糖。重复提取I次。除蛋白、透析和冷冻干燥按步骤2中方法进行，得淡黄色絮状的碱提桑黄菌丝体多糖，苯酚-硫酸法测得中性糖含量为84.9%，不含蛋白质，硫酸-咔唑法测得糖醛酸含量为 16.9%ο
【主权项】
1.一种连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，其特征在于按照下述步骤进行: 1)脱脂:将桑黄菌丝体粉碎，用有机溶剂以常规方式脱脂； 2)水提多糖制备； ①水提醇沉:步骤I)所得的脱脂后的桑黄菌丝体按l:10g/mL的料液比加入蒸馏水，950C回流提取8 h，离心，浓缩，4倍体积的95%乙醇沉淀，离心收集沉淀，得水提桑黄菌丝体粗多糖； ②除蛋白:步骤①所得的水提桑黄菌丝体粗多糖溶于蒸馏水，用氯仿和正丁醇组成的试剂去除其蛋白； ③透析:步骤②所得的除蛋白的多糖水溶液浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48 h，再在蒸馏水中透析48 h，除去寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集桑黄菌丝体多糖的提取液； ④冷冻干燥:步骤③所得的桑黄菌丝体提取液倒入玻璃培养皿中，_80°C预冻，冷冻干燥，得水提桑黄菌丝体多糖； 3)酸提多糖的制备:步骤2)中水提残留物加入草酸铵溶液，95°C回流提取8h，离心，浓缩，乙醇沉淀，除蛋白、透析和冷冻干燥按步骤2)中方法进行，得酸提桑黄菌丝体多糖； 4)碱提多糖的制备:步骤3)中酸提残留物加入氢氧化钠和硼氢化钠，室温下提取3h，离心，浓缩，加乙酸溶液，乙醇沉淀，除蛋白、透析和冷冻干燥按步骤2)中方法进行，得碱提桑黄菌丝体多糖。2.根据权利要求1所述的连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，其特征是，步骤I)所述的有机溶剂为石油醚，沸程30~60°C ;所述的常规方式为索氏抽提器中35°C回流6 h，自然晾干。3.根据权利要求1所述的连续制桑黄菌丝体多糖备的方法，其特征是，步骤①所述的离心速度为5000 rpm，离心时间为10 min。4.根据权利要求1所述的连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，其特征是，步骤②所述的氯仿和正丁醇按照5:1体积比混合。5.根据权利要求1所述的连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，其特征是，步骤③所述的透析袋的分子截留量为8000~12000 Da06.根据权利要求1所述的连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，其特征是，步骤3)所述的草酸铵溶液的质量浓度为1%。7.根据权利要求1所述的连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，其特征是，步骤4)所述的氢氧化钠浓度为1.25 mol/L，硼氢化钠质量浓度为0.05%，加入乙酸的终质量浓度为36%。
【专利摘要】本发明公开一种连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，属于生物工程技术领域。包括以下步骤：将脱脂处理后的桑黄菌丝体，95℃热水回流提取8h，离心，浓缩，乙醇沉淀，除蛋白，透析，冷冻干燥，得水提桑黄菌丝体多糖；水提残留物溶于1%草酸铵溶液，95℃回流提取8h，离心，浓缩，乙醇沉淀，除蛋白，透析，冷冻干燥，得酸提桑黄菌丝体多糖；酸提残留物溶于1.25mol/L氢氧化钠和0.05%硼氢化钠溶液，常温提取3h，离心，浓缩，加乙酸，乙醇沉淀，除蛋白，透析，冷冻干燥，得碱提桑黄菌丝体多糖。利用本发明连续制备的桑黄菌丝体多糖具有明显的清除自由基能力和抗氧化活性，且本发明的提取制备方法简单、易行、成本低、能规模化生产，并能应用于其他真菌菌丝体如灵芝、冬虫夏草、灰树花等。
【IPC分类】C08B37/00
【公开号】CN104910289
【申请号】CN201510331665
【发明人】闫景坤, 马海乐, 任晓锋, 王振斌, 裴娟娟
【申请人】江苏大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月16日