靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体，还涉及表达靶向 癌胚抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体，以及慢病毒表达载体的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 过继细胞治疗（adoptive cell therapy，ACT)是生物治疗技术的一种，对自体 免疫细胞（主要是T细胞）进行体外扩增，然后将其回输给肿瘤患者以达到治疗目的的 方法，被认为是继手术、放、化疗后的第4种治疗方式，在临床治疗中受到广泛应用。过继 细胞治疗广泛应用的主要是：淋巴因子活化的杀伤细胞（lymphokine activated killer cell，LAK)，与IL-2联合治疗晚期恶性肿瘤取得了一定疗效；肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL)，临床试验中治疗转移性黑色素瘤取得了较好的效果；细 胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell，CIK)，目前国内开展较多的临床 试验，对肝癌、肺癌等肿瘤取得了显著的效果。但是目前上述三种治疗方法均需活化T细 胞，T细胞活化需要两种活化信号，即T细胞表面的TCR-CD3与MHC- I分子结合为活化的 第一信号，决定T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；T细胞表面的共刺激分子与相应配体结合为 活化的第二信号，决定T细胞增殖。但肿瘤细胞、肿瘤微环境可下调MHC、配体分子，从而抑 制T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。因此需要可进行基因改造，主要有两种方式：基因转导 TCR(T cell receptor，TCR)和嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR)。
[0003] CAR是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域 依次连接组成，胞内信号域通常为CD3 ζ链或FcR γ，或与一种或多种共刺激分子相连，如 4_1BB(CD137)，CD28，IC0S(CD278)。肿瘤细胞表面的抗原（受体）与嵌合抗原受体的抗体 (配体）结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信 号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。嵌合抗原受体较TCR 改造更具优势：（1)特异性：抗体（配体）特异性识别抗原（受体）；(2)效率高：不会出现 转基因 TCR与患者内源性TCR发生错配；（3)非MHC- I限制性：不需要与MHC- I分子结 合，可克服肿瘤细胞、肿瘤微环境下调MHC- I分子造成的免疫逃逸；(4)抗原选择范围广： 抗原可以是糖类、脂类、蛋白质。目前CAR修饰的免疫细胞治疗的临床试验大量开展，其中， 抗CD19、CD20CAR修饰的T细胞治疗B系肿瘤效果显著。实体肿瘤临床试验则有抗叶酸嵌 合抗原受体治疗卵巢癌，抗碳酸酐酶IX (CAIX)嵌合抗原受体治疗肾癌，抗二唾液酸神经节 苷脂（GD2)嵌合抗原受体治疗经母细胞瘤等。
[0004] 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA)是一种糖蛋白，属于免疫球蛋白超家 族，相对分子质量为200kDa，最初由Gold和Freedman报道，表达于上皮源性肿瘤中如结直 肠癌，胃癌、肺癌、子宫内膜腺癌、卵巢癌，目前广泛应用于临床辅助诊断。BW431/26是CEA 特异性人单克隆抗体，是制备嵌合抗原受体的理想抗体。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体，表达该嵌 合抗原受体的免疫细胞（T细胞、NK细胞、B细胞等）可有效杀伤癌胚抗原阳性的肿瘤细胞， 而对癌胚抗原阴性的细胞无毒副作用；本发明的目的之二在于提供表达靶向癌胚抗原的嵌 合抗原受体的慢病毒表达载体；本发明的目的之三在于提供靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体 或表达祀向癌胚抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体在制备表达革El向癌胚抗原嵌合抗 原受体的免疫细胞中的应用；本发明的目的之四在于提供靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体或 表达靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体制备的表达靶向癌胚抗原嵌合抗原 受体的免疫细胞；本发明的目的之五在于提供靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体或表达靶向癌 胚抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体在制备治疗表达CEA抗原肿瘤的药物中的应用。
[0006] 为实现上述发明目的，经研宄，本发明提供如下技术方案：
[0007] 1、靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体依次由前导肽、靶向癌胚抗 原的单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸活化基序组成；所 述靶向癌胚抗原的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0008] 本发明中CEA抗原CEA基因家族成员5, CEACAM5 (⑶66e)，其抗原结合结构域采用 CEA特异性人源化单克隆抗体，如BW431/26, ZCE-025, hMN14等；优选为BW431/26来源的抗 体结合结构域。
[0009] 本发明中嵌合抗原受体信号传导结构域可以为⑶3 ζ、Fc ε RI γ信号链，优选的， 信号传导结构域为CD3G信号链。
[0010] 作为更优选的，所述嵌合抗原受体依次由前导肽、靶向癌胚抗原的单链抗体、连接 ScFv所用的铰链区、跨膜结构域、免疫共刺激分子、免疫受体酪氨酸活化基序组成；所述免 疫共刺激分子由CD28、CD134/0X40、CD137/4_1BB、LCK、ICOS和DAPlO胞内结构域的一种或 两种组成；更优选的，所述共刺激信号分子胞内为CD28和CD137结构域的组成。
[0011] 优选的，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示；所述连接ScFv所用的铰 链区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所 示，所述免疫共刺激分子由CD28和CD137胞内结构域组成，所述CD28胞内结构域氨基酸序 列如SEQ ID NO. 14所示，所述⑶137胞内结构域氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示，所述 免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；作为更优选的，CD28位于 CD 137上游。
[0012] 优选的，所述靶向癌胚抗原的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述前 导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；所述连接ScFv所用的铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，所述跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，所述CD28胞内结构域的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示，所述⑶137胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15 所示，所述免疫受体酪氨酸活化基序的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
[0013] 2、表达靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体，所述慢病毒载体的启动 子与终止子之间依次连有前导肽、靶向癌胚抗原的单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨 膜结构域和免疫受体酪氨酸活化基序；所述前导肽位于所述启动子下游，所述靶向癌胚抗 原的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0014] 优选的，所述慢病毒载体的启动子与终止子之间依次前导肽、靶向癌胚抗原的单 链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域、免疫共刺激分子和免疫受体酪氨酸活化基 序；所述前导肽位于所述启动子下游，所述靶向癌胚抗原的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述免疫共刺激分子由⑶28和⑶137胞内结构域组成。
[0015] 3、所述靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体或所述表达靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体 的慢病毒表达载体在制备表达靶向癌胚抗原嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用。
[0016] 本发明中免疫细胞可以为T细胞、B淋巴细胞，NK淋巴细胞，如CIK细胞、细胞毒性 T淋巴细胞（CTL)、单核细胞、中性粒细胞、调节T细胞，优选的所述免疫细胞为外周血来源 的T细胞。
[0017] 4、利用所述靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体或所述表达靶向癌胚抗原的嵌合抗原 受体的慢病毒表达载体制备的表达靶向癌胚抗原嵌合抗原受体的免疫细胞。
[0018] 本发明所述将载体导入免疫细胞的方法可以为基因枪法、电转法、病毒转导法，本 发明的一个实施方案中所述导入法为病毒转导法。
[0019] 5、所述靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体或所述表达靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体 的慢病毒表达载体在制备治疗表达CEA抗原肿瘤的药物中的应用。
[0020] 优选的，所述表达CEA抗原肿瘤包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、 胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、小肠腺癌、口腔癌或鼻咽癌。
[0021] 本发明中术语"嵌合抗原受体"是人工改造受体，能够将识别肿瘤抗原的特异性分 子（如抗体）锚定在免疫细胞（如T细胞）上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀 死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。
[0022] 本发明中术语"T细胞活化相关信号"是指与T细胞活化所需要两个信号，即T细 胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞 的杀伤特异性；
[0023] 本发明中术语"共刺激信号分子"(C〇-stimulating molecule)是指免疫细胞表面 的一些粘附分子，如⑶28、⑶134/0X40、⑶137/4-1BB、⑶40等，通过与其配体结合，激活免 疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞 的存活时间。
[0024] 本发明中术语"免疫受体酪氨酸活化基序"（immunoreceptor tyrosine-base activation motifs，ITAM)是指免疫细