以适量HBS在37°C、 5% CO2条件下孵育30min以完全去酯化。Calcium Green-I荧光强度变化采用激光共聚 焦扫描显微镜检测，通过培养皿的加药窗口用移液器加入特异性激动剂（capsaicin终浓 度为10 μ M，4 a -PDD终浓度为5 μ M)并记录细胞Calcium Green-I荧光强度动态变化。以 Calcium Green-I荧光强度对时间作图，求得激动剂刺激后Calcium Green-I荧光强度相对 于刺激前荧光强度的相对增加幅度为TRPVl或TRPV4的相对响应幅度。
[0102] 如图5所示，在加入特异性激动剂前，荧光记录结果显示不同结构上细胞均表现 出稳定的静止[Ca2+]。加入刺激剂10 μ M capsaicin或5 μ M 4 a -PDD后，细胞表现出瞬态 的胞内Calcium Green-I焚光强度或妈离子浓度变化。加入10 μΜ capsaicin刺激剂后， 细胞内Calcium Green-I荧光强度或钙离子浓度即刻迅速升高，后又迅速衰减并于刺激后 25秒内回到或接近刺激前荧光强度水平。这一现象反应了 TRPVl通道的快速去敏感化特 性，提示一次性注射给药法较之文献中同类研宄采用的连续灌流加样法具有更好的的靶标 响应质量。如表1所示，拓扑结构基底上阳性响应细胞比例或妈离子响应幅度较之平面基 底相应值增高。加入5 μ M4a -PDD刺激剂后，细胞内钙离子浓度同样即刻迅速升高，但其恢 复或下降过程较之于capsaicin刺激缓慢得多。表1中拓扑结构基底上细胞TRPV4阳性响 应细胞比率和钙离子响应幅度较之平面基底均全面明显升高。提示拓扑结构基底能增强靶 标响应性，有利于细胞生长和功能优化。
[0103]
[0104] 四、含微柱阵列的培养皿对H印G2细胞TRPVl和TRPV4相关mRNA的表达
[0105] TRPVl和TRPV4均可能是细胞的机械敏感离子通道或机械敏感性次级效应通道。 为了 了解拓扑结构基底对H印G2细胞TRPVl和TRPV4通道蛋白在基因水平表达的影响，用 qRT-PCR技术定量研宄了拓扑结构基底和平面基底上H印G2细胞TRPVl和TRPV4的mRNA相 对表达水平。HepG2细胞接种于4种拓扑结构基底和平面基底上复合培养3天后，分别提取 细胞总RNA进行qRT-PCR实验。
[0106] 如图6所示，拓扑结构上!fepG2细胞TRPVl和TRPV4的mRNA表达水平均高于平面 基底上的相应值。TRPVl和TRPV4基因在4-7 μ m结构上表达量均高于4-4 μ m结构上的相 应值，10-7 U m结构上表达量高于10-4 μ m结构；10-4 μ m结构上表达量高于4-4 μ m结构， 10-7 μ m结构上表达量高于4-7 μ m结构。在五种基底上TRPVl和TRPV4基因的表达强度依 次为：10-7μπι>4-7μπι>10-4μπι>4-4μπι>平面基底。上述结果提示，拓扑结构基底较之平 面基底上细胞TRPVl和TRPV4基因表达水平均显著增强，且相同微柱直径，较大微柱间距促 进TRPVl和TRPV4基因水平表达；相同微柱间距，较大微柱直径增强TRPVl和TRPV4基因表 达水平。
[0107] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置，其特征在于：包括：细胞培养皿 本体、培养皿板盖、具有拓扑结构基底的细胞培养池、细胞培养池固定并覆盖在细胞培养皿 本体上；在培养皿板盖上设置有加药窗口，其中加药窗口位于培养皿板盖的中心； 所述细胞培养池包括固定外框和培养孔板，所述培养孔板采用拓扑结构基底；所述固 定外框的尺寸与培养皿本体相对应，在固定外框的中部设置凹槽拓扑结构基底培养区，所 述凹槽培养区用于放置具有拓扑结构的基底，所述固定外框的边缘上还设置有培养液进液 口和培养液出液口，进液管和出液管采用可拆卸固定的方式通过进液口和出液口安插在细 胞培养池上。2. 根据权利要求1所述的一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置，其特征在 于：所述培养液进液口和培养液出液口在靠近培养平面的内侧设置有缓冲台阶，以保证细 胞及其生长所需营养液在腔内均匀分布。3. 根据权利要求1所述的一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置，其特征在 于：所述拓扑结构基底的培养孔板采用阵列排列的多个纵横相互平行的微柱。4. 根据权利要求1所述的一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置，其特征在 于：所述加药窗口能够实现密封，采用紧扣的方式设置在培养皿盖板上，通过加药窗口能够 实现一次性注射式加药。5. 根据权利要求1所述的一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置，其特征 在于：进液管和出液管均可安装阀门，可在操作需要时开启阀门，用于进出液或是灌流式加 药。6. 根据权利要求1所述的一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置，其特征在 于：所述进液口与出液口设有密封垫圈。7. 根据权利要求1所述的一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置，其特征在 于：微柱阵列基底、细胞培养池均为透明材质结构。8. 运用权利要求1-7中任一项所述的培养皿装置增强靶标响应性的方法，其特征在 于：包括以下步骤： 步骤一：培养皿的预处理：用裱衬液对所述的培养皿进行裱衬，得预处理后的培养皿； 步骤二：细胞靶标响应性功能的增强：将靶细胞在预处理后的培养皿中培养至少72小 时，并施以激动剂刺激得TPPVl和TRPV4钙离子通道功能响应性增强的靶细胞。9. 运用权利要求1-7中任一项所述的培养皿装置在增强细胞钙内流响应性的方法，其 特征在于：包括以下步骤： 步骤一：培养皿的预处理：用裱衬液对所述的培养皿的基底进行裱衬，裱衬时间至少 为2小时，得预处理后的培养皿； 步骤二：细胞培养：将细胞接种于经步骤A预处理后的培养皿； 步骤三：细胞TRPV离子通道钙内流荧光响应性的增强：微柱阵列拓扑结构培养皿中培 养的细胞先经钙离子荧光染料染色后，以普通荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、孔板读数器 或其他钙离子荧光记录装置采集细胞钙离子荧光信号，在信号采集过程中施以TRPV激动 剂刺激，得钙瞬态内流的离子通道荧光响应性。
【专利摘要】本发明公开了一种基于微柱阵列型拓扑结构基底的培养皿装置，包括培养皿本体和培养皿盖板，培养皿本体的培养池中基底表面设有至少一个微柱阵列，所述微柱面阵列中微柱的直径为微米级；本发明还包括以微柱阵列型基底增强细胞靶标功能响应性的方法，包括培养皿基底的预处理、细胞TRPV通道表达的增强以及通道在激动剂作用下的钙离子荧光信号检测等步骤。本培养皿中试剂加样可以采用经培养皿本体中加样管道的灌流式加样法或经盖板上加药窗口的一次性注射式加样法，以适应不同加药方法下通道药物靶标响应的特异性检测。运用本培养皿增强细胞TRPV通道功能响应性的方法为药物筛选或毒物评价提供了新的高靶标质量筛选及评价方法，和进一步高内涵和高通量应用思路。
【IPC分类】C12M1/22, C12M3/04, C12N5/09
【公开号】CN104928180
【申请号】CN201510366580
【发明人】吴泽志, 樊蓉, 宋明丽, 林雨, 钟冬火
【申请人】重庆大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月29日