一种应用贻贝检测水体污染物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境检测领域，具体涉及一种应用贻贝检测水体污染物的方法。
【背景技术】
[0002] 水产品是海洋和淡水渔业生产的动植物的统称，如鱼类、虾类、蟹类等。我国既是 水产品生产大国，同时也是消费大国。水产品的质量安全不仅关系着我国人民的生活健康， 也影响着水产品行业的发展，因此对水产品的质量安全检测具有重要意义。随着农、兽药的 滥用及环境污染的日益加剧，生物体持续暴露在多种污染物交叉的环境中，造成了其同时 遭受多种污染的现象。目前，对水产品中有毒有害物质的常规检测是各种化学手段，但其只 能针对部分有毒有害物质进行检测，并且对被生物体吸收代谢转化成的次级代谢产物无法 检测，同时还可能由于漏检某种有毒有害物质而产生严重后果。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种应用贻贝检测养殖水体中污染物的方法，即采用贻贝体 内谷胱甘肽硫转移酶（GSTs)的含量变化来检测养殖水体中污染物的方法。
[0004] 本发明的检测养殖水体中污染物的方法，包括如下的步骤：
[0005] 1)从贻贝肝脏组织中提取RNA，然后以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA ;
[0006] 2)用引物对步骤1)反转录合成cDNA进行荧光定量PCR检测，所述的引物为引物 的序列信息如下：
[0007] 正向引物 Yl :atagagcaacctagactggac (SEQ ID NO: 1)、
[0008] 反向引物 Y2 :gaaccagtgtgttactctctt (SEQ ID NO: 2)、
[0009] 设计的内参的序列信息如下：
[0010] 内参正向引物 YGl :cagaaggaaatcacagcacttg(SEQ ID N0:3)、
[0011] 内参反向引物 YG2 :gtccatgttaccaagcacga(SEQ ID N0:4);
[0012] 为了提高检测的灵敏度，正向引物的序列改造为ctagagcatgctagactgcag(SEQ ID NO:5)；
[0013] 3)通过对谷胱甘肽硫转移酶基因表达量的变化进行对比分析。
[0014] 所述的污染物，可以是农兽药、PAH、PCB、毒素、重金属、环境内分泌物。
[0015] 更具体的，所述的污染物为孔雀石绿、溴氰菊酯、多氯联苯。
[0016] 本发明的方法相比目前的仪器化学方法，其检出限更低，方法更加灵敏。且验证实 验室一致认为该方法准确、灵敏、操作简单、重复性好；不使用有毒的有机溶剂和标准品，对 操作人员的安全更有保障，同时减少了对环境的污染；缩短了检测时间，降低了检测成本， 有效地提升了实验室的检测能力。通过该项目的深入研宄，可建立与国际接轨的食品安全 生物检测体系。
【附图说明】
[0017] 图I :贻贝在受到孔雀石绿污染时GSTs基因表达量随孔雀石绿浓度变化的表达 图。经查阅文献得知，水中孔雀石绿在0. 03mg/L就就有较好的杀菌效果，因此，本实验组的 给药浓度依次设定为5、10、20、30和40 μ g/L，对照组为同样条件下不添加孔雀石绿养殖的 贻贝。由图可知，随着给药浓度的增大，贻贝GSTs基因相对表达量也随之明显增加，仅在 5 μ g/L浓度时其相对表达量就达1. 3倍，变化明显；其在在30 μ g/L和40 μ g/L浓度时相 对表达量持平，说明酶的表达在高浓度孔雀石绿中可能会受到抑制。
[0018] 图2 :贻贝在受到溴氰菊酯污染时GSTs基因表达量随溴氰菊酯浓度变化的表达 图。经查阅相关资料，实验组在溴氰菊酯经口给药浓度l〇mg/L时，72h后，鲢鱼死亡，本实验 选定在养殖水体中溴氰菊酯的给药浓度分别选择了 1、2、4、6和8mg/L，对照组为同样条件 下不添加溴氰菊酯养殖的贻贝。由图看出：随着给药浓度的增大，贻贝GSTs基因相对表达 量也随之增加，并表现出对溴氰菊酯敏感，其GSTs基因相对表达量在8mg/L时高了 1. 8倍 多；其在4mg/L、6mg/L和8mg/L浓度时表达量趋于平稳，说明该酶在这个浓度下开始趋于饱 和。
[0019] 图3 :贻贝在受到多氯联苯污染时GSTs基因表达量随多氯联苯浓度变化的表达 图。经过文献查阅，鱼的LD50为PCBs l-10yg/kg，96h ;5yg/L，45d。本实验选定了在养殖 水体中的给药浓度分别为〇. 1、〇. 5、1和2 μ g/L，对照组为同样条件下不添加多氯联苯养殖 的贻贝。由图看出：随着给药浓度的增大，GSTs基因相对表达量也随之增加，其中，在PCBs 浓度达2 μ g/L时，贻贝高了 2. 2倍；尤其值得一提的是，在PCBs浓度为0. 1 μ g/L时，鲢鱼 中GSTs基因相对表达量时就高了 1. 3倍，这说明鲢鱼的GSTs对PCBs的诱导反应很敏感， GSTs非常适合作为一种生物标志物来监测环境中PCBs存在情况。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述
[0021] 实施例1
[0022] 1、从贻贝肝脏组织中提取RNA，然后以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA ;
[0023] 材料：
[0024] 贻贝肝脏；RNA 提取试剂盒，RNAprep pure Tissue Kit，Tiangen ;反转录 Prime Script RT试剂盒：TaKaRa，日本；移液器；一次性注射器；方盘；镊子；手术剪；培养皿； I. 5mL离心管。
[0025] 试剂材料
[0026] 95 % 的 RNase-free 乙醇；0· 1 % DEPC 处理水；SV RNA Lysis Buffer ;SV RNA dilution Buffer ；SV RNA Wash Solution ；Yellow core Buffer ；MnCl20. 09M ；DNase I ；SV DNase Stop Solution ;Nuclease_Free water ;琼脂糖；10XTAE 电泳缓冲液（40m MTris， 20mM NaAc，ImM EDTA PH 8.0);载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）；溴化乙锭水溶液 (10mg/mL) 〇
[0027] 由于RNA容易被降解，整个提取过程中要严格防止RNA酶的污染。提取过程用到 的玻璃容器、EP管等样品需要用0· 1% (v/v)焦碳酸二乙醋（DEPC:diethypyrocarbonate) 浸泡处理。实验中用的微量移液器需要用75%的消毒酒精对表面进行消毒，超净台也要擦 拭干净，用消毒酒精消毒后，进行紫外灭菌30min以上。提取过程中，要带口罩和一次性PE 手套，实验过程需要勤换手套，严防RNA酶污染。
[0028] 肝脏中RNA的提取
[0029] 本次实验采用天根生化科技有限公司的RNApr印pure动物组织总RNA提取试剂 盒，对贻贝的肝脏RNA提取。
[0030] 具体步骤如下：
[0031] (1)分离贻贝的肝脏组织，分别取50mg样品于离心管中，加入175μ1 SV RNA Lysis Buffer，用一次性注射器将组织压碎、反复抽打混勾。#
[0032] (2)加 350 μ I SV RNA Dilution Buffer (蓝色），翻转管子 3-4 次混匀，置 70°C水 浴 3min〇
[0033] (3)冰上冷却1-2秒，HOOOrpm离心10min，上清液移入一新离心管。
[0034] ⑷加入200 μ 1 95%的乙醇，枪头混匀。
[0035] (5)将上述混合液移入 Spin Basket Assembly，HOOOrpm 离心 lmin，弃滤液。
[0036] (6)加入 600 μ I SV RNA Wash Solution (with ethand added)，HOOOrpm 离心 Imin，弃滤液。
[0037] (7)在一新离心管中配制 DNase incubation mix :
[0038] Yellow Core Buffer 40 μ I
[0039] MnCl20.0 9M 5 μ I
[0040] DNase I 5 μ I
[0041] (8)将上述50 μ 1混合液直接加在Spin Basket的膜上，室温（20-25°C )保育 15min〇
[0042] (9)加 200 μ I SV DNase Stop Solution (with ethand added)至 Spin Basketl4000rpm，离心 lmin〇
[0043] (10)力卩 600 μ I SV RNA Wash Solution，HOOOrpm 离心 lmin，弃滤液。
[0044] (11)力卩 250 μ I SV RNA Wash Solution，HOOOrpm 离心 2min，将 Spin Basket 转 移到一新离心管中。
[0045] (12)加 50 μ I Nuclease-Free Water 至膜上，HOOOrpm离心 lmin，溶解 RNA，-8CTC 保存。
[0046] (13)取5 μ I RNA样品，1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
[0047] 2、RNA质量检测
[0048] 琼脂糖凝胶电泳测定
[0049] (1)将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。
[0050] (2)配制琼脂糖凝胶：
[0051] 称取0. 5g琼脂糖，置干净的IOOrnl锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使 琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至60-70°C，依次向其中加入9mL甲醛、5ml IOx MOPS缓冲液 和0. 5 μ L溴化乙锭，混合均匀。
[0052] (3)准备RNA样品
[0053] 取DEPC处理过的500 μ L小离心管，依次加入如下试剂：10x MOPS缓冲液2uL，甲 醛3. 5 μ L，甲酰胺（去离子）10 μ L，RNA样品4. 5 μ L，混匀。将离心管置于60°C水浴中保 10分钟，再置冰上2分钟。向管中加入3 μ L上样染料，混匀。
[0054] (3)上样，电泳；电泳条件为0. 5XTAE电泳缓冲液、琼脂糖I. 2%、150V，15min。因 为细胞中的RNA主要是rRNA，其含量为70 %~80 %，所以电泳检测到的主要是rRNA条带。 电泳结果表明rRNA条带非常明显，28S rRNA条带和18S rRNA条带亮度很清楚，而5. 8S rRNA条带则相对较弱，且在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可 能是由mRNA和其它异型RNA组成。电泳检测说明提取的RNA完整性较好。
[0055] 利用紫外分光光度计检测了提取RNA的纯度。一般来讲，检测RNA的纯度可以通 过OD26tlmZOD28tlmi比值来反映，高质量RNA的OD 26Qmi/OD28Qmi比值在L 8~2. 1之间，而比值较 小则提取的RNA不纯，表明有蛋白质的污染。测定结果表明，提取的RNA的OD26cimZOD28tol为 1.9,表明RNA纯度较好。
[0056] 3、反转录合成cDNA
[0057] 1)以提取的mRNA为模板，利用反转录Prime Script RT试剂盒反转录合成cDNA。
[0058] 构建10 μ L的反应体系：
[0059]
[0060] 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
[0061] 反转录程序为：37°C，15min进行反转录，85°C，5s灭活酶反应。制备的cDNA放置 于-80°C冰箱保存。
[0062] 2)引物设计
[0063] 通过NCBI获得不同来源贻贝的谷胱甘肽S转移酶（G